日本同仁化学Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号:E297- DOJINDO

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Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号:E297
氧消耗量检测试剂盒
Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit
商品信息
储存条件:-20度保存
运输条件:常温

特点:

 

● 适用于普通荧光酶标仪

● 不需要昂贵的仪器、特殊介质和孔板

● 带OCR计算表的一体式试剂盒

 

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操作事项

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Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号:E297

Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号:E297

产品解说
产品规格
OCR计算器
OCR是线粒体功能的重要指标
产品概述
与现有方法比较
与石英分析仪对比
实验例:抑制线粒体电子传输链
实验例:细胞最大呼吸能力评估
实验例:不同细胞系代谢途径依赖性的比较
Q&A
参考文献

产品解说

 

产品规格

Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号:E297

OCR计算器

 

OCR是线粒体功能的重要指标

由于氧主要在线粒体氧化磷酸化产生三磷酸腺苷(ATP)的过程中消耗,因此其耗氧率(OCR)是分析线粒体功能的指标。众所周知,癌细胞通过糖酵解途径产生ATP,其效率低于氧化磷酸化。在免疫细胞中,氧化磷酸化的优势是抑制抗肿瘤,而糖酵解途径的优势促进抗肿瘤作用。因此,细胞的OCR作为能量代谢的检测指标。

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产品概述

细胞外氧消耗量试剂盒包括氧气探针,其具有随着介质中氧气浓度的降低而增加荧光强度的特性,矿物油阻止氧气从空气中流入。

在用荧光酶标仪根据细胞外氧浓度测量荧光强度之后,根据Stern-Volmer方程计算细胞的OCR(自动计算表)。

Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号:E297Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒货号:E297

*该产品在群马大学Toshitada Yoshihara博士的指导下实现了产品化。

与现有方法比较

到目前为止,OCR测量需要昂贵的设备,如通量分析仪,实时动态检测酶标仪,以及酶标仪的功能调节。该试剂盒推荐给初此使用的人,因为它可以与常规荧光酶标仪一起使用,并附带所有必要试剂的完整包装。

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与石英分析仪对比

石英分析仪(XFe24)和本试剂盒在相同条件下(细胞类型、细胞数量和FCCP浓度)进行测量。

得到XFe24与本试剂盒相关氧消耗速度变化的数据。

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细胞种类: HepG2

细胞数: 5×10⁴ cells/well

试剂: FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)

FCCP 浓度: 2 μmol/l

实验例:抑制线粒体电子传输链

用抗霉素刺激大鼠细胞,评估线粒体电子运输链抑制后细胞状态的变化,检测多种指标。

结果表明,电子传输链的抑制导致(1)线粒体膜电位的降低和(2)OCR的降低。此外,观察到(3)整个糖酵解途径的NAD+/NADH比率降低,这是由于丙酮酸到乳酸的代谢增加,以维持糖酵解通路;(4)由于活性氧(ROS)增加,GSH耗竭;(6)由于谷胱甘肽生物合成所需NADPH减少,NADP+/NADPH比率增加。

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实验例:细胞最大呼吸能力评估

在HepG2细胞中,通过FCCP刺激后OCR值的变化来评估细胞的最大呼吸。

在FCCP浓度分别2µmol/l和4µmol/l 测量OCR。与2µmol/l相比,在4µmol/l时观察到OCR降低,表明在2µmol/l FCCP时最大呼吸。
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细胞: HepG2

细胞数: 5×104 cells/well

试剂: FCCP

FCCP 浓度 2, 4 μmol/l

实验例:不同细胞系代谢途径依赖性的比较

    许多癌症细胞通过糖酵解途径产生ATP。另一方面,最近有报道称,糖酵解途径被抑制的癌症细胞,可通过增强线粒体功能将能量代谢转移到OXPHOS而达到存活的目的,代谢途径的依赖性因细胞系不同而异。

基于乳酸生成、ATP水平和OCR值,比较了两种癌症细胞HeLa和HepG2中OXPHOS和糖酵解的依赖性关系。

<通过乳酸生产和ATP水平进行评估>

我们证实了当寡霉素刺激和糖酵解途径中的 2-Deoxy-D-glucose(2-DG)抑制OXPHOS的ATP合成时,ATP和乳酸产生的变化。结果表明,HeLa细胞依赖于糖酵解,HepG2细胞依赖于OXPHOS合成ATP。

*有关结果的更多信息,请参下方的“所用技术和产品的补充信息”部分。

所用技术和产品的补充信息
<通过乳酸产生和ATP的量进行评估>

当OXPHOS在HeLa细胞中被抑制时,ATP水平保持不变(①),乳酸产生增加(②)。这表明,即使OXPHOS被抑制,糖酵解也可以被进一步激活。相反,当糖酵解被抑制时,ATP水平显著降低(③),表明能量的产生依赖于糖酵解。另一方面,当OXPHOS在HepG2细胞中被抑制时,乳酸的产生增加(④),表明细胞试图通过增强糖酵解来补偿能量的产生,但ATP水平仍然降低(⑤)。这意味着,即使糖酵解增加,ATP的产生也没有得到足够的代偿。此外,当糖酵解被抑制时,ATP水平下降更多(⑥),这表明HepG2细胞的能量产生更多地依赖于OXPHOS而不是糖酵解。

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本数据同时使用了:糖酵解/氧化磷酸化检测试剂盒—Glycolysis/OXPHOS Assay Kit(G270)

<OCR值评估>

使用相同数量的细胞,我们测量了当用线粒体解偶联剂FCCP刺激细胞来促进细胞耗氧量时的OCR值。结果表明,HepG2细胞比HeLa细胞具有更高的OCR值,这表明对OXPHOS的依赖性更强,这与ATP水平和乳酸产生的结果有关。

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〈实验条件〉

细胞系:HeLa、HepG2

细胞数:5×104个细胞/孔

刺激:FCCP

浓度:2μmol/l

使用:Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒(货号:E297)进行评估

Q&A

Q:本试剂盒可以检测多少样本?
A:当测试一种细胞类型的相同数量的细胞时,可以测量24个样品。

*如果实验中使用了两种以上的细胞类型或多个细胞编号,则必须准备单独的空白和对照,并且可以测量的样本数量会有所不同。

有关详细信息,请参考手册中的板布局示例。

Q:悬浮细胞有什么实验案例吗?
A:我们准备了一个大鼠细胞实验的例子。<说明>

(1) 将大鼠细胞(3.0×106细胞/ml)悬浮于RPMI培养基中作为空白3,将大鼠细胞(3.0×106细胞/ml)悬于工作溶液中作为对照或样品。将细胞接种在100µl(300000个细胞/孔)的96孔黑色透明底部微孔板中。

 

(2) 向空白1中加入100µl RPMI培养基,向空白2中加入100μl工作溶液。

 

(3) 将微孔板放置在预先设定为37°C的读板器中,孵育30分钟。

 

(4) 向空白1、空白2、空白3和对照品中加入10µl RPMI培养基。

 

(5) 将用RPMI培养基稀释的样品溶液(抗霉素或FCCP溶液)分10µl加入样品中。

 

(6) 加入样品溶液后,立即向每个孔中加入一滴矿物油。

 

(7) 将微板放置在37°C的平板读数器中,孵育5分钟。

 

(8) 在一个时间过程中,用荧光板读取器每10分钟测量一次强度,持续200分钟(Ex:500nm,Em:650nm,底部读数)。

(9) OCR值通过将获得的强度值输入下载的专用Excel计算表来计算。

每孔所需的样品和试剂数量。

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Q:如何使用此试剂盒计算OCR?
A:请使用Excel计算表并遵循以下说明

 

<OCR计算程序概述>

(1) 将OCR测量获得的强度值输入计算表,使用Stern-Volmer公式自动计算氧含量(nmol)。

(2) 根据时间(min)与氧含量(nmol)的关系图,检查所有测量条件下获得的线性范围。

(3) 计算步骤(2)中确认的时间(min)和氧含量(nmol)范围内的斜率。

(4) 根据步骤(3)中计算的斜率计算OCR(pmol/min)。

有关详细信息,请参阅手册中的“分析”。

*需要计算OCR的客户请至【网站首页】-【技术支持】-【实验工具】即可找到OCR计算器

 

Q:矿物油对细胞有细胞毒性吗?
A: 当通过Cell Counting Kit-8细胞毒性测定测定时,在用矿物油处理的细胞中未观察到毒性。

 

Q:为什么使用此试剂盒需要搭配可控温的酶标仪?
A: 在添加试剂和矿物油后,将微孔板与培养箱(或加热块、恒温室等)一起孵育,酶标仪中的温差将影响OCR结果。这导致数据再现性下降。因此,请使用温度可控的酶标仪。

<常规操作>

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步骤3、7用于悬浮细胞,步骤5、9用于贴壁细胞

<孵育环境对结果的影响>

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Q:OCR检测后如何测量细胞数
A:使用核酸探针(代码:H342)Hoechst 33342测量每个孔的细胞数,这是该方案的一个示例。

<说明>

(1) 将细胞接种到孔中进行OCR测量(液体体积:100μl/孔)。

(2) 将制备校准曲线的细胞接种到孔中(液体体积:100μl/孔)。

(3) OCR根据说明书进行测量。

(4) 向孔中加入10µl/孔的介质进行校准(使介质体积与OCR测量孔的体积对齐至110µl/孔)。

(5) 将用培养基稀释的Hoechst 33342溶液(10µg/ml)以100µl/孔的速度添加到所有孔中。

*从油的顶部添加OCR测量孔。

(6) 在37°C下培养30分钟。

(7) 用荧光板读数器(Ex:350nm,Em:461nm)测量。

(8) 制备校准曲线(X轴:细胞数量,Y轴:荧光强度),并计算用于OCR测量的孔中的细胞数量。

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Q:可以长期存储工作液吗
A 工作液不能储存,需要现配现用。
Q:氧探针或矿物油的反复冷冻和解冻是否会影响测定?
A 我们已经证实,氧气探针和矿物油的反复冻融循环对测定没有影响。
Q:对照组与实验组之间OCR没有差异,有哪些可能得原因?
A请检查以下两个实验条件。

(1) 如果在测量过程中温度发生变化,可能会影响OCR结果。请确保以下两个步骤完全按照说明书执行。

・矿物油、溶剂和稀释溶剂等溶液在使用前应预热至37°C左右。

・加入试剂和矿物油后,请使用温度可控的酶标仪进行孵育。

请参阅Q&A“为什么使用此试剂盒需要搭配可控温的酶标仪?”。

(2) 建议在最终计算前,优化单元格数据。如果细胞数量较低,实验组和对照组之间的差异也可能并不显著。

【带有细胞数和试剂处理的OCR值(预期结果图)】

 

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参考文献

 

文献 研究对象 引用文献
1 细胞(HepG2) K.Saito.et al“Obesity-induced metabolic imbalance allosterically modulates CtBP2 to inhibit PPAR-alpha transcriptional activity”2023,Journal of Biological Chemistry,doi.org/10.1016/j.jbc.2023.104890
2 细胞(NIH3T3-L1) S. Oki, S. Kageyama, Y. Morioka and T. Namba, “Malonate induces the browning of white adipose tissue in high-fat diet induced obesity model”Biochem Biophys Res Commun.2023, doi:10.1016/j.bbrc.2023.08.054.
3 细胞

(Primary Hepatocyte)

S. Tsuno, K. Harada, M. Horikoshi, M. Mita, T. Kitaguchi, M. Y. Hirai, M. Matsumoto and T. Tsubo , ‘Mitochondrial ATP concentration decreases immediately after glucose administration to glucose-deprived hepatocytes’, FEBS Open Bio2023, doi:10.1002/2211-5463.13744.
  4 精子 “Arresting calcium-regulated sperm metabolic dynamics enables prolonged fertility in poultry liquid semen storage”, Scientific Reports 2023 , doi: 10.1038/s41598-023-48550-2.
5 细胞(HepG2) Takeo Nakanishi.et alAn implication of the mitochondrial carrier SLC25A3 as an oxidative stress modulator in NAFLDExperimental Cell Research.,2023,431,113740

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氧消耗量检测试剂盒
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商品信息
储存条件:-20度保存
运输条件:室温

特点:

 

● 适用于普通荧光酶标仪

● 不需要昂贵的仪器、特殊介质和孔板

● 带OCR计算表的一体式试剂盒

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100tests

现货

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产品规格
OCR是线粒体功能的重要指标
产品概述
与现有方法比较
与石英分析仪对比
实验例:抑制线粒体电子传输链
实验例:细胞最大呼吸能力评估
实验例:不同细胞系代谢途径依赖性的比较
Q&A
参考文献

产品规格

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OCR是线粒体功能的重要指标

由于氧主要在线粒体氧化磷酸化产生三磷酸腺苷(ATP)的过程中消耗,因此其耗氧率(OCR)是分析线粒体功能的指标。众所周知,癌细胞通过糖酵解途径产生ATP,其效率低于氧化磷酸化。在免疫细胞中,氧化磷酸化的优势是抑制抗肿瘤,而糖酵解途径的优势促进抗肿瘤作用。因此,细胞的OCR作为能量代谢的检测指标。

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产品概述

细胞外氧消耗量试剂盒包括氧气探针,其具有随着介质中氧气浓度的降低而增加荧光强度的特性,矿物油阻止氧气从空气中流入。

在用荧光酶标仪根据细胞外氧浓度测量荧光强度之后,根据Stern-Volmer方程计算细胞的OCR(自动计算表)。

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*该产品在群马大学Toshitada Yoshihara博士的指导下实现了产品化。

与现有方法比较

到目前为止,OCR测量需要昂贵的设备,如通量分析仪,实时动态检测酶标仪,以及酶标仪的功能调节。该试剂盒推荐给初此使用的人,因为它可以与常规荧光酶标仪一起使用,并附带所有必要试剂的完整包装。

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与石英分析仪对比

石英分析仪(XFe24)和本试剂盒在相同条件下(细胞类型、细胞数量和FCCP浓度)进行测量。

得到XFe24与本试剂盒相关氧消耗速度变化的数据。

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细胞种类: HepG2

细胞数: 5×10⁴ cells/well

试剂: FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)

FCCP 浓度: 2 μmol/l

实验例:抑制线粒体电子传输链

用抗霉素刺激大鼠细胞,评估线粒体电子运输链抑制后细胞状态的变化,检测多种指标。

结果表明,电子传输链的抑制导致(1)线粒体膜电位的降低和(2)OCR的降低。此外,观察到(3)整个糖酵解途径的NAD+/NADH比率降低,这是由于丙酮酸到乳酸的代谢增加,以维持糖酵解通路;(4)由于活性氧(ROS)增加,GSH耗竭;(6)由于谷胱甘肽生物合成所需NADH减少,NADP+/NADPH比率增加。

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实验例:细胞最大呼吸能力评估

在HepG2细胞中,通过FCCP刺激后OCR值的变化来评估细胞的最大呼吸。

在FCCP浓度分别2µmol/l和4µmol/l 测量OCR。与2µmol/l相比,在4µmol/l时观察到OCR降低,表明在2µmol/l FCCP时最大呼吸。
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细胞: HepG2

细胞数: 5×104 cells/well

试剂: FCCP

FCCP 浓度 2, 4 μmol/l

实验例:不同细胞系代谢途径依赖性的比较

    许多癌症细胞通过糖酵解途径产生ATP。另一方面,最近有报道称,糖酵解途径被抑制的癌症细胞,可通过增强线粒体功能将能量代谢转移到OXPHOS而达到存活的目的,代谢途径的依赖性因细胞系不同而异。

基于乳酸生成、ATP水平和OCR值,比较了两种癌症细胞HeLa和HepG2中OXPHOS和糖酵解的依赖性关系。

<通过乳酸生产和ATP水平进行评估>

我们证实了当寡霉素刺激和糖酵解途径中的 2-Deoxy-D-glucose(2-DG)抑制OXPHOS的ATP合成时,ATP和乳酸产生的变化。结果表明,HeLa细胞依赖于糖酵解,HepG2细胞依赖于OXPHOS合成ATP。

*有关结果的更多信息,请参下方的“所用技术和产品的补充信息”部分。

所用技术和产品的补充信息
<通过乳酸产生和ATP的量进行评估>

当OXPHOS在HeLa细胞中被抑制时,ATP水平保持不变(①),乳酸产生增加(②)。这表明,即使OXPHOS被抑制,糖酵解也可以被进一步激活。相反,当糖酵解被抑制时,ATP水平显著降低(③),表明能量的产生依赖于糖酵解。另一方面,当OXPHOS在HepG2细胞中被抑制时,乳酸的产生增加(④),表明细胞试图通过增强糖酵解来补偿能量的产生,但ATP水平仍然降低(⑤)。这意味着,即使糖酵解增加,ATP的产生也没有得到足够的代偿。此外,当糖酵解被抑制时,ATP水平下降更多(⑥),这表明HepG2细胞的能量产生更多地依赖于OXPHOS而不是糖酵解。

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本数据同时使用了:糖酵解/氧化磷酸化检测试剂盒—Glycolysis/OXPHOS Assay Kit(G270)

<OCR值评估>

使用相同数量的细胞,我们测量了当用线粒体解偶联剂FCCP刺激细胞来促进细胞耗氧量时的OCR值。结果表明,HepG2细胞比HeLa细胞具有更高的OCR值,这表明对OXPHOS的依赖性更强,这与ATP水平和乳酸产生的结果有关。

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〈实验条件〉

细胞系:HeLa、HepG2

细胞数:5×104个细胞/孔

刺激:FCCP

浓度:2μmol/l

使用:Oxygen Consumption Rate(OCR) Plate Assay Kit-氧消耗量检测试剂盒(货号:E297)进行评估

Q&A

Q:本试剂盒可以检测多少样本?
A:当测试一种细胞类型的相同数量的细胞时,可以测量24个样品。

*如果实验中使用了两种以上的细胞类型或多个细胞编号,则必须准备单独的空白和对照,并且可以测量的样本数量会有所不同。

有关详细信息,请参考手册中的板布局示例。

Q:悬浮细胞有什么实验案例吗?
A:我们准备了一个大鼠细胞实验的例子。<说明>

(1) 将大鼠细胞(3.0×106细胞/ml)悬浮于RPMI培养基中作为空白3,将大鼠细胞(3.0×106细胞/ml)悬于工作溶液中作为对照或样品。将细胞接种在100µl(300000个细胞/孔)的96孔黑色透明底部微孔板中。

 

(2) 向空白1中加入100µl RPMI培养基,向空白2中加入100μl工作溶液。

 

(3) 将微孔板放置在预先设定为37°C的读板器中,孵育30分钟。

 

(4) 向空白1、空白2、空白3和对照品中加入10µl RPMI培养基。

 

(5) 将用RPMI培养基稀释的样品溶液(抗霉素或FCCP溶液)分10µl加入样品中。

 

(6) 加入样品溶液后,立即向每个孔中加入一滴矿物油。

 

(7) 将微板放置在37°C的平板读数器中,孵育5分钟。

 

(8) 在一个时间过程中,用荧光板读取器每10分钟测量一次强度,持续200分钟(Ex:500nm,Em:650nm,底部读数)。

(9) OCR值通过将获得的强度值输入下载的专用Excel计算表来计算。

每孔所需的样品和试剂数量。

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Q:如何使用此试剂盒计算OCR?
A:请使用Excel计算表并遵循以下说明

 

<OCR计算程序概述>

(1) 将OCR测量获得的强度值输入计算表,使用Stern-Volmer公式自动计算氧含量(nmol)。

(2) 根据时间(min)与氧含量(nmol)的关系图,检查所有测量条件下获得的线性范围。

(3) 计算步骤(2)中确认的时间(min)和氧含量(nmol)范围内的斜率。

(4) 根据步骤(3)中计算的斜率计算OCR(pmol/min)。

有关详细信息,请参阅手册中的“分析”。

*需要计算OCR的客户请至【网站首页】-【技术支持】-【实验工具】即可找到OCR计算器

 

Q:矿物油对细胞有细胞毒性吗?
A: 当通过Cell Counting Kit-8细胞毒性测定测定时,在用矿物油处理的细胞中未观察到毒性。

 

Q:为什么使用此试剂盒需要搭配可控温的酶标仪?
A: 在添加试剂和矿物油后,将微孔板与培养箱(或加热块、恒温室等)一起孵育,酶标仪中的温差将影响OCR结果。这导致数据再现性下降。因此,请使用温度可控的酶标仪。

<常规操作>

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步骤3、7用于悬浮细胞,步骤5、9用于贴壁细胞

<孵育环境对结果的影响>

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Q:OCR检测后如何测量细胞数
A:使用核酸探针(代码:H342)Hoechst 33342测量每个孔的细胞数,这是该方案的一个示例。

<说明>

(1) 将细胞接种到孔中进行OCR测量(液体体积:100μl/孔)。

(2) 将制备校准曲线的细胞接种到孔中(液体体积:100μl/孔)。

(3) OCR根据说明书进行测量。

(4) 向孔中加入10µl/孔的介质进行校准(使介质体积与OCR测量孔的体积对齐至110µl/孔)。

(5) 将用培养基稀释的Hoechst 33342溶液(10µg/ml)以100µl/孔的速度添加到所有孔中。

*从油的顶部添加OCR测量孔。

(6) 在37°C下培养30分钟。

(7) 用荧光板读数器(Ex:350nm,Em:461nm)测量。

(8) 制备校准曲线(X轴:细胞数量,Y轴:荧光强度),并计算用于OCR测量的孔中的细胞数量。

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Q:可以长期存储工作液吗
A 工作液不能储存,需要现配现用。
Q:氧探针或矿物油的反复冷冻和解冻是否会影响测定?
A 我们已经证实,氧气探针和矿物油的反复冻融循环对测定没有影响。
Q:对照组与实验组之间OCR没有差异,有哪些可能得原因?
A请检查以下两个实验条件。

(1) 如果在测量过程中温度发生变化,可能会影响OCR结果。请确保以下两个步骤完全按照说明书执行。

・矿物油、溶剂和稀释溶剂等溶液在使用前应预热至37°C左右。

・加入试剂和矿物油后,请使用温度可控的酶标仪进行孵育。

请参阅Q&A“为什么使用此试剂盒需要搭配可控温的酶标仪?”。

(2) 建议在最终计算前,优化单元格数据。如果细胞数量较低,实验组和对照组之间的差异也可能并不显著。

【带有细胞数和试剂处理的OCR值(预期结果图)】

 

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参考文献

文献 研究对象 引用文献
1 细胞(HepG2) K.Saito.et al“Obesity-induced metabolic imbalance allosterically modulates CtBP2 to inhibit PPAR-alpha transcriptional activity”2023,Journal of Biological Chemistry,doi.org/10.1016/j.jbc.2023.104890
2 细胞(NIH3T3-L1) S. Oki, S. Kageyama, Y. Morioka and T. Namba, “Malonate induces the browning of white adipose tissue in high-fat diet induced obesity model”Biochem Biophys Res Commun.2023, doi:10.1016/j.bbrc.2023.08.054.
3 细胞

(Primary Hepatocyte)

S. Tsuno, K. Harada, M. Horikoshi, M. Mita, T. Kitaguchi, M. Y. Hirai, M. Matsumoto and T. Tsubo , ‘Mitochondrial ATP concentration decreases immediately after glucose administration to glucose-deprived hepatocytes’, FEBS Open Bio2023, doi:10.1002/2211-5463.13744.
  4 精子 “Arresting calcium-regulated sperm metabolic dynamics enables prolonged fertility in poultry liquid semen storage”, Scientific Reports 2023 , doi: 10.1038/s41598-023-48550-2.
5 细胞(HepG2) Takeo Nakanishi.et alAn implication of the mitochondrial carrier SLC25A3 as an oxidative stress modulator in NAFLDExperimental Cell Research.,2023,431,113740

日本同仁化学Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging试剂货号:MT05- DOJINDO

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Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging试剂货号:MT05
线粒体内单线态氧荧光探针试剂
Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging
商品信息
储存条件:-20度保存,避光
运输条件:室温
分子式:

C35H37ClN2Si

分子量:

549.22

特点:

 

● 能够对活细胞进行荧光成像

● 对单线态氧的高选择性

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选择规格:
2μg

现货

 
线粒体检测方案

Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging试剂货号:MT05

Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging试剂货号:MT05

产品概述
原理
荧光特性
反应特异性
实验例
常见问题Q&A
参考文献

产品概述

       单线态氧(Singlet Oxygen,1O2)是一种具有强氧化性的活性氧(ROS),是造成皮肤斑点及皱纹的重要因素。在化妆品等研究中,去除单线态氧是重要的研究目的。在癌症研究领域,单线态氧在光动力疗法(PDT:一种采用光敏药物和激光活化治疗肿瘤的新兴抗癌疗法)中起到关键作用。因此检测活细胞内的单线态氧对于了解PDT的抗癌机理至关重要。但是现有的荧光探针由于不能穿透细胞膜,所以无法用于活细胞检测。

Majima等人合成了一种由含硅罗丹明和蒽环构成的新型远红外荧光探针Si-DMA,分别作为发色团和单线态氧反应位点。当存在单线态氧时会在Si-DMA的蒽环部位生成内过氧化物,Si-DMA的荧光强度会增强1)。在7种不同活性氧中,Si-DMA能够特异性地检测单线态氧(图3)。另外在用5-氨基乙酰丙酸(5-ALA,一种血红素前体)处理细胞后,Si-DMA可以实时观察到线粒体中原卟啉IX产生单线态氧的变化情况(图4)。

原理

Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging试剂货号:MT05

图1. Si-DMA的细胞染色原理

荧光特性

Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging试剂货号:MT05

图2. Si-DMA与单线态氧反应后的激发和发射光谱

反应特异性

Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging试剂货号:MT05

图3. Si-DMA对各种ROS的选择性

实验例

实验例1  荧光显微镜观察用5-氨基乙酰丙酸 (5-ALA) 处理后的HeLa细胞中的单线态氧

1. 接种200 μl HeLa细胞 (2.4×105 cells/ml) 在μ-slide 8孔板 (ibidi) ,培养基为DMEM (10%FBS,1%青霉素-链霉素),

在37℃ 5% CO2培养箱中过夜培养。

2. 用200 μl Hanks’ HEPES 缓冲液洗涤细胞2次。

3. 在μ-slide 8孔板中加入200 μl 含5-ALA的Hanks’ HEPES 缓冲液 (150 μg/ml),在37℃ 5% CO2培养箱中培养4 h。

4. 用Hanks’ HEPES 缓冲液洗涤细胞2次。

5. 加入200 μl Si-DMA工作液(40 nmol/l), 在37℃ 5% CO2培养箱中培养45 min。

6. 用200 μl Hanks’ HEPES缓冲液洗涤细胞2次。

7. 加入200 μl Hanks’ HEPES缓冲液,并用荧光显微镜进行观察。

Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging试剂货号:MT05

Si-DMA检测5-ALA处理的HeLa细胞线粒体中的单线态氧的荧光成像

5-ALA处理过的HeLa细胞经过2.5 min照射后,Si-DMA的荧光增强,因此Si-DMA可以用于实时监测线粒体中原卟啉IX产生的单线态氧。

滤镜 (波长/带通型滤光片)

荧光成像:600±25 nm (Ex), 685±25 nm (Em)

实验例2  线粒体中的单线态氧检测 

Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging试剂货号:MT05

用终浓度为50 μmol/l的过氧化氢和终浓度为50 μmol/l的次氯酸刺激或不刺激HeLa细胞,用Si-DMA检测到细胞中产生的单线态氧。和线粒体染料(MitoBright Green: MT06)共染,特异性地在线粒体中检测到了单线态氧。

波长(激发波长/发射波长)

Si-DMA: 600±25 nm/685±25 nm

MitoBright Green: 488 nm/501-563 nm

实验例3  观察用H2O2处理Primary Hepatocytes细胞后产生的单线态氧

Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging试剂货号:MT05

Si-DMA检测用H2O2刺激Primary Hepatocytes细胞后产生的单线态氧荧光成像

实验条件:

用10 mM H2O2刺激Primary Hepatocytes 20 min。

细胞数量:1×104/dish

容器:Nest 15 mm共聚焦培养皿801002

染色条件:在37℃ 5% CO2培养箱中染色45 min

Si-DMA工作液浓度:100 nmol/l

检测仪器:激光共聚焦显微镜

仪器品牌:Leica,Cambridge, UK

仪器型号:BMI-6000

Ex:600 nm,Em: 685 nm

(以上数据由东方肝胆外科医院信号转导实验室友情提供)

常见问题Q&A

Q1、本试剂盒与现有方法相比有什么优势?
A1:本试剂盒的优点是“能够对活细胞进行荧光成像”和“对单线态氧的高选择性”。在操作说明中有详细的实验数据。
Q2、DMSO Stock Solution的稳定性怎么样?
A2:DMSO Stock Solution配制后在-20℃及避光条件下可以保存大约1个月,建议根据每次的用量进行分装保存。
Q3、配制Working Solution可以用Hanks’ HEPES以外的缓冲液吗?
A3:还可以用HBSS缓冲液。
Q4、Working Solution的稳定性怎么样?
A4:Working Solution不稳定,请在配制当天使用。

参考文献

1、S. Kim, T. Tachikawa, M. Fujitsuka, T. Majima, “Far-Red Fluorescence Probe for Monitoring Singlet Oxygen during Photodyanamic Therapy”, J. Am. Chem. Soc., 2014, 136 (33), 11707.

2、S. Bekeschus, A. Mueller, U. Gaipl, KD. Weltmann, “Physical plasma elicits immunogenic cancer cell death and mitochondrial singlet oxygen”, TRPMS., 2017, 99, DOI:10.1109/TRPMS.2017.2766027.

3、Y. D. Riani, T. Matsuda, K. Takemoto and T. Nagai, “Green monomeric photosensitizing fluorescent protein for photo-inducible protein inactivation and cell ablation “, BMC Biol, 2018, 16, 50.

4、T. Guo, T. Liu, Y. Sun, X. Liu, R. Xiong, H. Li, Z. Li, Z. Zhang, Z. Tian, and Y. Tian, “Sonodynamic therapy inhibits palmitateinduced beta cell dysfunction via PINK1/ Parkin-dependent mitophagy”, Cell Death Dis., 2019, 10, 457.

5、K. Murotomi, A. Umeno, S, Sugino and Y. Yoshida. , “Quantitative kinetics of intracellular singlet oxygen generation using a fluorescence probe”, Sci Rep, 2020, 10, 10616.

6、Y. Fujita, M. Iketani, M. Ito, I. Ohsawa, “Temporal changes in mitochondrial function and reactive oxygen species generation during the development of replicative senescence in human fibroblasts”, 2022, doi:10.1016/j.exger.2022.111866.

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