线粒体在生成ATP的同时会生成超氧化物。正常情况下，细胞的抗氧化酶等物质会保护细胞免受活性氧的伤害。但是，当线粒体功能异常时，活性氧过量积累会造成细胞的各种机能紊乱。因此在评价细胞氧化应激水平时，往往需要同时检测线粒体的膜电位和线粒体的活性氧。

对各种活性氧的反应选择性

mtSOXDeep Red相较于T公司的产品Red，在各种活性氧中，对超氧化物的选择性更高。

另外，与其他公司产品所不同的是，mtSOX  Deep Red拥有独特的荧光特性(λex: 540 nm; λem: 670 nm)，可以同时进行线粒体膜电位检测试剂(JC-1 货号MT09; MT-1 货号MT13)的共染色实验。

线粒体超氧化物和线粒体膜电位的同时检测

用HBSS清洗HeLa细胞后，使用mtSOX和同仁化学研究所的线粒体膜电位检测试剂(JC-1 货号MT09或MT-1 货号MT13)进行共染色实验，同时观察线粒体ROS和线粒体膜电位。

结果显示，伴随着线粒体ROS的产生，线粒体膜电位也逐渐降低。

<使用JC-1的实验操作>

<检测条件>

JC-1:绿Ex=488 nm; Em= 490-520 nm; 红Ex=561 nm; Em= 560-600 nm

mtSOX:Ex=633 nm; Em= 640-700 nm

Scale bar: 10 μm

<检测条件>

JC-1:绿Ex=485 nm; Em= 535 nm; 红Ex=535 nm; Em= 595 nm

mtSOX:Ex=550 nm; Em= 675 nm

<使用MT-1的实验操作>

<检测条件>

MT-1: Ex=561 nm; Em= 560-600 nm

mtSOX:Ex=633 nm; Em= 640-700 nm

Scale bar: 10 μm

<检测条件>

MT-1: Ex=545 nm; Em= 600 nm;

mtSOX:Ex=550 nm; Em= 675 nm

细胞内Total ROS和线粒体超氧化物的同时检测

用HBSS清洗HeLa细胞后，使用mtSOX和同仁化学研究所的细胞内ROS检测试剂(ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA- 货号：R252)进行共染色实验，通过线粒体超氧化物诱导剂Antimycin或过氧化氢诱导后进行荧光观察。

结果显示，可以分别观察到细胞内ROS诱导后的荧光增强和线粒体的ROS诱导后的荧光增强。

<实验操作>

<Antimycin刺激的结果>

<检测条件>

细胞内ROS:  Ex=488 nm; Em= 490-520 nm

mtSOX:Ex=633 nm; Em= 640-700 nm

Scale bar: 10 μm

衰老细胞线粒体超氧化物检测

提示：脂褐素内源性荧光最小化

脂褐素对细胞衰老研究的影响

众所周知，衰老细胞会积累被称为脂褐素的氧化损伤蛋白质，这些蛋白质不会被溶酶体降解。线粒体作为溶酶体中的不溶性物质，导致荧光观察过程中背景增加。在细胞衰老研究中，有必要尽量减少脂褐素或其他物质对内源性荧光的影响。

使用升级后的荧光探针

我们分别使用T公司的产品和Dojindo公司的mtSOX Deep Red-线粒体超氧化物检测用荧光染料，检测在增殖期（第2代）和衰老（第14代）TIG-1细胞（人胎肺来源的成纤维细胞）中观察到线粒体超氧化物。

结果显示：在T公司的产品（染色浓度：5 μmol/l）的情况下，除了在增殖细胞和衰老细胞中观察到线粒体荧光外，还观察到很强的荧光背景。从未染色细胞的图像中发现该背景荧光是内源性荧光。另一方面，当使用mtSOX Deep Red（染色浓度：1μmol/l）时，可以观察到线粒体超氧化物产生的荧光，而荧光背景的影响很小。在观察线粒体超氧化物时，重要的是比较灵敏度、波长和通道，然后用合适的荧光探针进行观察，以最大限度地减少内源性荧光的产生。

※mtSOX的最佳浓度因细胞而异。关于不同染色浓度下内源性荧光的不同影响的讨论，请参阅”常见问题Q＆A”：解答当我观察衰老细胞时，发现线粒体外的荧光，应该如何处理？。

＜实验数据＞

本实验数据，由东京都老年病学研究所Fujita Yasunori教授友情提供。

＜参考文献＞

Y. Fujita, M. Iketani, M. Ito and I. Ohsawa, “Temporal changes in mitochondrial function and reactive oxygen species generation during the development of replicative senescence in human fibroblasts”,  Exp. Gerontol., 2022, 165, 111866.

1、D. Sun, S. Cui, H. Ma, P. Zhu, N. Li, X. Zhang, L. Zhang, L. Xuan, J. Li , “Salvianolate ameliorates renal tubular injury through the Keap1/Nrf2/ARE pathway in mouse kidney ischemia-reperfusion injury”, 2022, J. Ethnopharmacol., doi:10.1016/j.jep.2022.115331.

2、Y. Fujita, M. Iketani, M. Ito, I. Ohsawa, “Temporal changes in mitochondrial function and reactive oxygen species generation during the development of replicative senescence in human fibroblasts”, 2022, Exp. Gerontol.,  doi:10.1016/j.exger.2022.111866.

3、R. Inoe, T. Tsuno, Y. Togashi, T. Okuyama, A. Sato, K. Nishiyama, M. Kyohara, J. Li, S. Fukushima, T. Kin, D. Miyashita, Y. Shiba, Y. Atobe, H. Kiyonari, K. Bando, A. S. Shapiro, K. Funakoshi, R. N. Kulkarni, Y. Terauchi, and J. Shirakawa, “Uncoupling protein 2 and aldolase B impact insulin release by modulating mitochondrial function and Ca2+ release from the ER”, 2022, iScience,  doi:10.1016/j.isci.2022.104603.

4、A. Patel, M. Simkulet, S. Maity, M. Venkatesan, A. Matzavinos, M. Madesh & B. R. Alevriadou, “The mitochondrial Ca2+ uniporter channel synergizes with fluid shear stress to induce mitochondrial Ca2+ oscillations”, 2022, Sci. Rep., doi:10.1038/s41598-022-25583-7.

5、Hao Gu, Yuhui Zhu, Jiawei Yang, Ruixue Jiang, Yuwei Deng, Anshuo Li, Yingjing Fang, Qianju Wu, Honghuan Tu, Haishuang Chang, Jin Wen, Xinquan Jiang,”Liver-Inspired Polyetherketoneketone Scaffolds Simulate Regenerative Signals and Mobilize Anti-Inflammatory Reserves to Reprogram Macrophage Metabolism for Boosted Osteoporotic Osseointegration.Advanced Science”，2023, Advanced Science, doi：10.1002/advs.202302136