日本同仁化学DNA损伤定量试剂盒——DNA Damage Quantification Kit -AP Site Counting DK02- DOJINDO

发表于2024年6月19日由whatman中国官网

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DNA损伤定量试剂盒——DNA Damage Quantification Kit -AP Site Counting DK02

氧化应激与自由基

氧是合成激素和ATP等生物活性物质的一种重要的分子。获得利用氧的能力是生命进化的重要的驱动力。氧可以激活细胞中的各种酶，被激活的氧种类涉及细胞功能的运作。尽管氧本身是生命的一个基本元素，但在氧化应激中，诸如DNA和蛋白质等细胞中的分子有时会被活性氧 (Reactive oxygen species, ROS) 破坏。

抗氧化能力

活性氧

谷胱甘肽

DNA损伤

脂质过氧化物

铁离子

谷氨酰胺、谷氨酸

自由基

NO研究

品名货号用途

DNA损伤定量试剂盒——DNA Damage Quantification Kit -AP Site Counting	DK02	DNA损伤定量检测
DPPP试剂	D350	氧化应激检测

细胞中的氧化应激是由代谢、电离辐射和与DNA直接相互作用的致癌化合物产生的ROS导致的。在代谢的过程中，小部分的氧由于一个电子的还原变成超氧阴离子，接着超氧阴离子被超氧化物岐化酶 (SOD) 转变成氧气和过氧化氢。过氧化氢由过氧化氢酶或谷胱甘肽过氧化物酶还原成水。然而如果过氧化氢并没有被这些酶完全还原，当它被铁(Fenton反应)氧化将产生反应性极强的羟自由基。羟自由基还可以由紫外线照射产生或直接电离辐射水产生。羟自由基可以与脂反应产生脂质过氧化物。然而并非所有ROS都是有害的。次氯酸盐离子是一种由中性粒细胞的髓过氧化物酶产生的过氧化氢衍生而来的ROS，它具有杀菌活性。NO也称为内皮来源的舒张因子，它是由NO合成酶产生的。不过NO和超氧阴离子反应可产生具有细胞毒性的过氧亚硝基阴离子。ROS和活性氮化合物在生物系统中具有许多不同的活性。相应地好氧生物会产生防止氧化应激的防御机制。最近在对防御机制以及氧化损伤与疾病或老化过程之间关系的研究中，氧化应激已成为许多研究的焦点。最终已发展出许多用于检测ROS相关或ROS来源的物质的方法，这些物质包括超氧阴离子、超氧化物岐化酶、谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶、DNA损伤、8-氧基鸟嘌呤、8-硝基鸟嘌呤和蛋白质羰基等。

日本同仁化学ICG Labeling Kit – NH2试剂盒 LK31 ICG 标记氨基- DOJINDO

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ICG Labeling Kit – NH2试剂盒 LK31 ICG 标记氨基（50-200ug/sample）

蛋白抗体标记

简单、迅速的标记试剂盒 Dojindo Labeling Kits是一系列包含了活性试剂以及特制的过滤管，可以简便标记抗体等蛋白质的试剂盒。样品预处理-反应-纯化的整个过程都在一支过滤管中完成，3个小时内就能获得标记产物。1次可以标记50-200 μg的样品。使用本试剂盒的过滤管来纯化样品，与凝胶过滤和透析法相比，回收率要高很多，适合用于标记一些比较贵重的抗体。试剂盒中包含了标记产物的保存溶液，标记产物在保存溶液中能够稳定保存。Dojindo Labeling Kits能够标记分子量在50,000以上的大分子。其中辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶标记试剂盒还可以标记分子量在5,000以下的小分子。标记方法有两种：一种是氨基标记法，另一种是巯基标记法。氨基标记法采用带有N-hydroxysuccinimide (NHS) 基的活化试剂，能够标记抗体等样品上的氨基。巯基标记法采用带有Maleimide基的活化试剂，能够标记还原抗体等样品上带有巯基的化合物。根据样品的特性可以选择不同的标记方法。

生物素

荧光标记

酶标记物

螯合标记

藻胆蛋白

ICG标记

IgG纯化分离

交联剂

品名货号用途

ICG Labeling Kit – NH2试剂盒	LK31	ICG 标记氨基（50-200ug/sample）

日本同仁化学Allophycocyanin Labeling Kit – NH2试剂盒 LK21 藻蓝蛋白（APC）标记-氨基- DOJINDO

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Allophycocyanin Labeling Kit – NH2试剂盒LK21藻蓝蛋白（APC）标记-氨基（50-200ug/sample）

蛋白抗体标记

生物素

荧光标记

酶标记物

螯合标记

藻胆蛋白

ICG标记

IgG纯化分离

交联剂

品名货号用途

Allophycocyanin Labeling Kit – NH2试剂盒	LK21	藻蓝蛋白（APC）标记-氨基（50-200ug/sample）
Allophycocyanin Labeling Kit – SH试剂盒	LK24	藻蓝蛋白（APC）标记-巯基（50-200ug/sample）
R-Phycoerythrin Labeling Kit – NH2试剂盒	LK23	藻红蛋白(PE)标记-氨基（50-200ug/sample）
R-Phycoerythrin Labeling Kit – SH试剂盒	LK26	藻红蛋白（PE）标记-巯基（50-200ug/sample）
Ab-10 Rapid R-Phycoerythrin Labeling Kit试剂盒	LK34	R-藻红蛋白(PE)抗体标记-氨基（10 ug/sample）

日本同仁化学eroxidase Labeling Kit – NH2试剂盒 LK11 辣根过氧化物酶（HRP）标记-氨基- DOJINDO

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蛋白抗体标记

生物素

荧光标记

酶标记物

螯合标记

藻胆蛋白

ICG标记

IgG纯化分离

交联剂

品名货号用途

Peroxidase Labeling Kit – NH2试剂盒	LK11	辣根过氧化物酶（HRP）标记-氨基（50-200ug/sample）
Peroxidase Labeling Kit – SH试剂盒	LK09	辣根过氧化物酶（HRP）标记-巯基（50-200ug/sample）
Peroxidase Labeling Kit – NH2 (for 1mg)试剂盒	LK51	辣根过氧化物酶（HRP）标记-氨基（1 mg/sample）
Ab-10 Rapid Peroxidase Labeling Kit试剂盒	LK33	辣根过氧化物酶（HRP）标记-氨基（10 ug/sample）
Alkaline Phosphatase Labeling Kit – NH2试剂盒	LK12	碱性磷酸酶标记（ALP）-氨基（50-200ug/sample）
Alkaline Phosphatase Labeling Kit – SH试剂盒	LK13	碱性磷酸酶标记（ALP）-巯基（50-200ug/sample）

日本同仁化学Biotin Labeling Kit – NH2试剂盒 LK03 生物素标记-氨基（50-200ug/sample）- DOJINDO

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生物素

荧光标记

酶标记物

螯合标记

藻胆蛋白

ICG标记

IgG纯化分离

交联剂

品名货号用途

Biotin Labeling Kit – NH2试剂盒	LK03	生物素标记-氨基（50-200ug/sample）
Biotin Labeling Kit – NH2 (for 1mg)试剂盒	LK55	生物素标记-氨基（1 mg/sample）
Biotin Labeling Kit – SH试剂盒	LK10	生物素标记-巯基（50-200ug/sample）
Ab-10 Rapid Biotin Labeling Kit试剂盒	LK37	生物素标记-氨基（10 ug/sample）
Biotinylation Kit (Sulfo-OSu)试剂	BK01	生物素标记-氨基（1-5 mg/sample）
Biotin-PE-maleimide试剂	B592	生物素
Biotin-SS-Sulfo-Osu试剂	B572	生物素
Biotin-AC5-Osu试剂	B305	生物素
Biotin-(AC5)2-Osu试剂	B306	生物素
Biotin-Osu试剂	B304	生物素
Biotin-PEAC5-maleimide试剂	B299	生物素
ARP(Aldehyde Reactive Probe)试剂	A305	生物素

日本同仁化学AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 细胞内吞作用的内化过程检测货号：A558- DOJINDO

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AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 细胞内吞作用的内化过程检测货号：A558

AcidSensor Labeling Kit – 细胞内吞作用的内化过程检测

AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay

商品信息

储存条件：0-5度保存，避光

运输条件：常温

特点：

● pH敏感型荧光标记染料

● 试剂盒包括所有试剂

● 详细的标记手册

下载说明书

细胞内吞宣传资料

选择规格：

3 samples

期货

微环境酸性时发出荧光

AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 细胞内吞作用的内化过程检测货号：A558

产品概述

原理

与其他产品的比较

实验例1

实验例2

实验例3

常见问题Q&A

产品概述

本款试剂盒一套试剂盒就包含了全部所需材料，可以对目标物质的内吞作用进行可视化分析。

AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 细胞内吞作用的内化过程检测货号：A558

试剂盒中包含的NH2-反应性AcidSensor（荧光探针）具有分子内活性酯基，与含氨基的目标物质（蛋白质）混合后形成稳定的共价键。AcidSensor标记后可在633纳米处被激发，可满足同时与绿色或红色荧光进行多重染色。

AcidSensor标记后在中性条件下几乎没有荧光，而在细胞中受环境酸化影响后会发出荧光，并被内吞作用所吸收。

AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 细胞内吞作用的内化过程检测货号：A558

*注意：

・与内吞作用的检测染料ECGreen（产品代码：E296）不同，本试剂盒是对进入细胞的目标物质进行染色。

本试剂盒可以标记分子量超过50,000和含有活性氨基的样本。

・本试剂盒也会标记分子量在10,000以上的除标记样本以外的含氨基的共存物质，这些物质也会被标记和回收。请在使用前对样品溶液进行纯化。

原理

AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 细胞内吞作用的内化过程检测货号：A558

AcidSensor的反应原理与细胞内吞途径的示意图

AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 细胞内吞作用的内化过程检测货号：A558

与其他产品的比较

AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 细胞内吞作用的内化过程检测货号：A558

实验例1

THP-1 细胞对标记凋亡细胞的吞噬作用实验

AcidSensor 标记的物质会被细胞吸收，当它们到达溶酶体等酸性细胞器时，荧光会增强。利用这一特性，我们通过将 AcidSensor 标记的凋亡细胞与 Calcein 标记的 THP-1 巨噬细胞共培养来评估凋亡细胞的吞噬活性。结果，通过流式细胞术观察到了钙蓝蛋白（绿色）/AcidSensor（深红色）双阳性细胞，表明 THP-1 巨噬细胞吞噬了凋亡细胞（图 1a）。此外，当细胞松弛素 D 抑制 THP-1 巨噬细胞的吞噬作用时，双阳性细胞的比例也会下降（图 1b 和 1c），这证实该检测系统能准确评估吞噬作用。

最近的一份报告显示，抑制线粒体功能会诱导培养的小胶质细胞（中枢神经系统中的常驻巨噬细胞）转向糖酵解并减少吞噬作用*。为了复制这一结果，我们使用线粒体抑制的 THP-1 巨噬细胞进行了吞噬试验。结果显示，短链氯化石蜡是线粒体氧化磷酸化的强效解偶联剂，它能降低 THP-1 巨噬细胞的线粒体膜电位（MT-1，红色）（图 2）并减少吞噬作用（图 3）。

AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 细胞内吞作用的内化过程检测货号：A558

使用产品：

①AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 【货号: A558】

② -Cellstain- Calcein-AM 【货号：C542】

③ MT-1 MitoMP Detection Kit 【货号：MT13】

实验步骤：

制备 AcidSensor 标记的凋亡细胞（检测前一天）

1. 向 NH2-Reactive AcidSensor 中加入 10 μl DMSO 并溶解。将 5 μl NH2-Reactive AcidSensor 溶液加入 5 ml HBSS，制成工作液（稀释 1000 倍）。

2. 用 HBSS 冲洗 Jurkat 细胞两次。

3. 将 Jurkat 细胞（5×107 个）转移到试管中，离心后去除上清液。

4. 将工作液加入到装有 Jurkat 细胞（5×107 个）的试管中并悬浮。

5. 5. 37°C 孵育 30 分钟，用 AcidSensor 进行标记。

6. 标记后，用 HBSS 冲洗细胞两次。

7. 将标记了 AcidSensor 的 Jurkat 细胞悬浮在含有 10%FBS、添加了 0.5 μM 石杉碱的 RPMI 培养基中。

8. 在培养箱（37°C，5% CO2）中隔夜培养 18 小时，诱导细胞凋亡。

使用 THP-1 巨噬细胞进行吞噬试验

1. 为了将 THP-1 细胞分化成巨噬细胞，将 THP-1 细胞以 1×106 个细胞/孔的数量播种到 6 孔板中，然后在培养箱中用 100 nM PMA 培养 3 天。

2. 2. 用 HBSS 冲洗 THP-1 巨噬细胞两次后，在孔中加入含 HBSS 溶液的 Calcein-AM（货号：C542，0.5 μg/ml）和 MT-1（货号：MT13，1000 倍稀释），在培养箱中培养 30 分钟。

3. 用培养液清洗两次。

4. 用 10 μM Cytochalasin D培养 1 小时，或用 5 μM FCCP 培养 30 分钟。

5. 用培养液清洗两次后，将 AcidSensor 标记的凋亡细胞（3×106 个细胞/孔）加入到含有或不含细胞松驰素 D 或 FCCP 的孔中。细胞在培养箱中培养 4 小时。

6. 用 HBSS 冲洗两次。

7. 加入 500 μl Imaging 缓冲溶液（货号：MT13），用细胞刮板收集平板上的 THP-1 巨噬细胞。

8. 用流式细胞仪分析细胞悬浮液。

实验例2

使用AcidSensor标记的BSA和小鼠IgG被HeLa细胞吸收的情况

使用该试剂盒将标记的BSA或小鼠IgG加入HeLa细胞中，2小时后观察HeLa细胞的吸收情况。

结果，在HeLa细胞中检测到了AcidSensor的荧光，证实两种标记的物体都被内吞途径吸收了。

AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 细胞内吞作用的内化过程检测货号：A558

＜检测条件＞

仪器:共聚焦显微镜

Ex = 633 nm, Em = 650-700 nm

实验例3

与内体染料共染

标记的IgG的细胞摄取量随时间变化

用本试剂盒的AcidSensor标记的小鼠IgG和Dojindo的内吞检测染料（货号E296, ECGreen -Endocytosis Detection）一同添加到HeLa细胞中。

染色后10分钟、20分钟和180分钟观察细胞，结果显示AcidSensor（深红色）和内体膜（绿色）在同一位置定位，表明小鼠IgG是通过内吞作用途径被细胞吸收的。

AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 细胞内吞作用的内化过程检测货号：A558

＜检测条件＞

绿：ECGreen

(Ex = 405 nm, Em= 500-550 nm)

紫：AcidSensor

(Ex = 633 nm, Em= 650-700 nm)

常见问题Q&A

Q1: 样品溶液中存在的物质是否会影响标记反应？

A1:

取决于存在的物质种类。

在确认溶液中含有哪些物质后，对样品进行相应的纯化。

样品中共存的带有氨基的化合物和分子量超过10,000的化合物会降低标记效率，并且由于其分子量高，不能被过滤管去除。即使是没有氨基的化合物，高分子量的杂质也会造成过滤器的堵塞，从而影响标记和纯化。请在使用前对样品进行纯化。

Q2:回收标记体所使用的WS buffer是否有细胞毒性？

A2: WS buffer中含有几乎不会对细胞产生毒性的稳定剂（表面活性剂）。如果无论如何还是介意表面活性剂，可以根据自身习惯来选择合适的缓冲液来回收标记体。

Q3:如果用含有血清的培养基回收标记体，是否会影响观察？

A3: 血清中的成分虽然不会对AcidSensor的性能产生影响，但是由于血清中的蛋白质也会通过内吞途径进入细胞，可能会与标记的蛋白质的摄取产生竞争。请您根据自身实验目的进行判断。

Q4:如何计算标记率？

A4: A用WS buffer 5倍稀释标记体，然后检测500 nm和280 nm处的吸光度，按照下列公式进行计算，得出标记率。

AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 细胞内吞作用的内化过程检测货号：A558

A500： 500 nm 的吸光度

A280： 280 nm 的吸光度

εprotein：蛋白质的280 nm处的摩尔吸光系数

NH2-Reactive AcidSensor 在WS buffer中的 A500 的摩尔吸光系数为[48400]。

NH2-Reactive AcidSensor 在280nm和500nm的吸光度、280nm/500nm的比值为[0.16]。

Q5:每个蛋白质分子上会有多少个AcidSensors标记上？

A5:对于小鼠IgG，我们已经确认每个分子平均有三个AcidSensors被标记。

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日本同仁化学Cell Counting Kit-Luminescence试剂盒货号：CK18 细胞活性（ATP检测）- DOJINDO

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Cell Counting Kit-Luminescence试剂盒货号：CK18 细胞活性（ATP检测）

ATP Assay Kit-Luminescence

商品信息

储存条件：0-5°C

运输条件：常温

特点：

● 操作简便，检测仅需10分钟

● 灵敏度高，微量细胞也可检测

● 悬浮细胞和原代细胞适合

选择规格：

200 tests

600 tests

1000 tests

2000 tests

现货

不可定量检测（无标准品）

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Cell Counting Kit-Luminescence试剂盒货号：CK18 细胞活性（ATP检测）

产品解说

活动进行中

产品原理

实验注意事项

实验操作步骤

参考文献

产品解说

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订购满5000元，300元礼品等你拿

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产品原理

ATP是生物体内最直接的能量来源，在肌肉收缩、代谢反应、主动运输等方面被广泛使用，甚至被称作生物体内的能量货币。同仁化学研究所开发的Cell Counting Kit-Luminescence试剂盒是一种通过Luciferase来确定细胞中的腺苷三磷酸（ATP）的细胞增殖-毒性检测试剂盒。

本试剂盒只需将各试剂混合后加入孔板，10 分钟后即可检测。不需要去除培养基、清洗细胞等复杂的操作。此外，本试剂盒还有诸如发光的半衰期在3 小时以上、数据的重现性高、兼容96孔板、384孔板的多样品检测等诸多优点。

Cell Counting Kit-Luminescence试剂盒货号：CK18 细胞活性（ATP检测）

图1. Cell Counting Kit Luminescence 检测原理

实验注意事项

检测方法：多功能酶标仪

检测结果：化学发光值

Cell Counting Kit-Luminescence试剂盒货号：CK18 细胞活性（ATP检测）

注意：该试剂盒只能比较实验组对照组结果，但是不能完全定量检测

（试剂盒内不含标准品）

实验操作步骤

1. 白色 96 孔板中，每孔加入 100 μl 细胞悬液（白色 384 孔板，每孔加入 25 μl 细胞悬液）。

*为了获得更准确的检测结果，建议每个实验组至少设置三个复孔（n=3）。

2. 各孔中加入 100 μl Working solution（白色 384 孔板，每孔加入 25 μl Working solution）。

*气泡会对实验结果产生影响，如果孔中有气泡请尽量清除。使用电动移液器时，建议使用反向吸液模式(RevPIP Mode)。

*加入 Working solution 后，建议用酶标仪的振荡混匀功能震荡 2 min。由于光照会影响检测结果，如果必须在有光源的地方震荡，建议用铝箔纸包覆孔板。

3. 将孔板静置于温度设定在 25℃的酶标仪内 10 min。

*如果酶标仪没有温度设定的功能，请将孔板至于 25℃培养箱或 25℃左右室温下，避光培养 10 min。

*为了保证发光信号的稳定性，建议此处的培养时间不要低于 10 min。

4. 检测发光值（RLU）。

CCK-L，仪器检测实验例，详见如下：（实验例仅供参考）

细胞内ATP活性检测（CCK-L）的仪器设置

参考文献

编号	文献	年	IF
1	Impact of the combined timing of PD-1/PD-L1 inhibitors and chemotherapy on the outcomes in patients with refractory lung cancer, ESMO Open,2021, 6(2):100094	2021	6.5
2	SIRT3-Mediated SOD2 and PGC-1α Contribute to Chemoresistance in Colorectal Cancer Cells ,Annals of Surgical Oncology,2021, 28(8):4720-4732	2021	5.3
3	An Fc-muted bispecific antibody targeting PD-L1 and 4-1BB induces antitumor immune activity in colorectal cancer without systemic toxicity，Cellular & Molecular Biology Letters， 2023，doi.org/10.1186/s11658-023-00461-w	2023	8.3

日本同仁化学Lipid Droplet Assay Kit-Deep Red试剂货号：LD06 脂滴荧光检测（深红色）- DOJINDO

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Lipid Droplet Assay Kit-Deep Red试剂货号：LD06

脂滴荧光检测（深红色）

Lipid Droplet Assay Kit-Deep Red

商品信息

储存条件：冷暗处保存

运输条件：室温

特点：

● 高特异性脂滴定位

● 可流式定量检测

● 多种颜色可供选择

下载说明书

宣传资料

选择规格：

1set

现货

点击查看更多脂滴荧光选择

Lipid Droplet Assay Kit-Deep Red试剂货号：LD06 脂滴荧光检测（深红色）

产品解说

活动进行中

试剂盒内含

概述

原理

特点

实验例

脂肪滴产品选择指南

参考文献

产品解说

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Lipid Droplet Assay Kit-Deep Red试剂货号：LD06 脂滴荧光检测（深红色）

概述

同仁化学研究所研发的Lipid Droplet Assays Kit-Blue＆Deep Red试剂盒，与油红O和尼罗红不同，只需简单操作即可选择性的检测LDs。与尼罗红相比试剂盒中的染色剂，具有更好的选择性，从而将荧光背景降低到最小值。此外，试剂盒中的Loading Buffer可维持检测过程中细胞的状态完好。本试剂盒可使用流式细胞仪检测活细胞或固定细胞，也可用于荧光酶标仪进行高通量检测。

原理

脂滴(脂肪滴，Lipid droplets, LDs)由中性脂肪组成，主要包括甘油三酯和胆固醇酯，其外层被一层单层磷脂分子包裹。而且脂滴不仅在脂肪细胞中存在，在真核生物中也普遍存在。最新的研究表明，以前认为脂滴仅是一个简单的脂质储存器，但最近的研究表明其在调节脂质代谢¹⁾，自噬²⁾和细胞衰老³⁾等方面都起着重要作用，因此需要进一步详细地研究脂滴形成·成长·融合·分解的机制。Lipi系列探针是高脂肪亲油性小分子探针，可在疏水环境例如脂滴中发出强荧光。Lipi探针染色后，无须洗涤即可观察到脂滴。

Lipid Droplet Assay Kit-Deep Red试剂货号：LD06 脂滴荧光检测（深红色）

1) T. Fujimoto et al., “Lipid droplets: a classic organelle with new outfits.” Histochem Cell Biol., 2008, 130(2), 263.

2) R. Singh et al., “Autophagy regulates lipid metabolism.” Nature, 2009, 458(7242), 1131.

3) M. Yokoyama et al., “Inhibition of endothelial p53 improves metabolic abnormalities related to dietary obesity.” Cell Reports, 2014, 7(5), 1691.

特点

特点1：定量专用试剂盒

试剂盒包含所需的工作液和缓冲液、可以简便实现定量脂滴。

Lipid Droplet Assay Kit-Deep Red试剂货号：LD06 脂滴荧光检测（深红色）

特点2：大幅度缩短操作，活细胞也可以使用

Lipid Droplet Assay Kit中使用的荧光染料可用于活细胞和固定细胞。因此，与使用比色法试剂相比可以大大缩短检测所需的时间。此外，由于染料不会沉积在孔板上，所以可以提高实验的重现性。

Lipid Droplet Assay Kit-Deep Red试剂货号：LD06 脂滴荧光检测（深红色）

实验例

实验例1：孔板检测实验例

将油酸或Triacsin C(acyl-CoA synthetase抑制剂）分别加入到A549细胞中，并使用Lipid Droplet Assay Kit对脂滴的变化进行定量。结果表明，与对照和加入Triacsin C的细胞相比，加入油酸的细胞中脂滴量有所增加。

Lipid Droplet Assay Kit-Deep Red试剂货号：LD06 脂滴荧光检测（深红色）

<检测条件>

Blue：Ex: 376 – 386 nm、 Em: 435 – 455 nm

Deep Red ：Ex: 623 – 633 nm、 Em: 649 – 669 nm

实验例2：流式细胞术的实验例

将油酸或Triacsin C(acyl-CoA synthetase抑制剂）分别加入到HeLa细胞中，并使用Lipid Droplet Assay Kit对脂滴的变化进行定量。结果表明，与对照和加入Triacsin C的细胞相比，加入油酸的细胞中脂滴量有所增加。

Lipid Droplet Assay Kit-Deep Red试剂货号：LD06 脂滴荧光检测（深红色）

< 检测条件>

Blue：Ex: 405 nm、 Em: 425 – 475 nm

Deep Red ：Ex: 640 nm、 Em: 650 – 670 nm

脂肪滴产品选择指南

	产品名称	规格	货号
成像(成像) 脂滴荧光探针	Lipi-Blue	10 nmol	LD01
	Lipi-Green	10 nmol	LD02
	Lipi-Red	100 nmol	LD03
	Lipi-Deep Red	10 nmol	LD04
定量（荧光酶标仪，FCM）脂滴荧光检测试剂盒	Lipid Droplet Assay Kit – Blue	1 set	LD05
定量（荧光酶标仪，FCM）脂滴荧光检测试剂盒	Lipid Droplet Assay Kit – Deep Red	1 set	LD06

参考文献

1. Fujimoto,T.et al., “Lipid droplets: a classic organelle with new outfits”Histochem Cell Biol., 2008, 130(2), 263.

2. Singh,R.et al., “Autophagy regulates lipid metabolism”Nature, 2009, 458(7242), 1131.

3. Yokoyama, M.et al., “Inhibition of endothelial p53 improves metabolic abnormalities related to dietary obesity”Cell Reports, 2014, 7(5), 1691.

4. Oka, M.et al., “Exogenous Cytokine-Free Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Classical Brown Adipocytes”, Cells., 2019, 8, (4), 373.

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日本同仁化学Lipid Droplet Assay Kit-Blue试剂货号：LD05 脂滴荧光检测（蓝色）- DOJINDO

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Lipid Droplet Assay Kit-Blue试剂货号：LD05

脂滴荧光检测（蓝色）

Lipid Droplet Assay Kit-Blue

商品信息

储存条件：冷暗处保存

运输条件：室温

特点：

● 高特异性脂滴定位

● 可流式定量检测

● 多种颜色可供选择

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Lipid Droplet Assay Kit-Blue试剂货号：LD05 脂滴荧光检测（蓝色）

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实验例

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Lipid Droplet Assay Kit-Blue试剂货号：LD05 脂滴荧光检测（蓝色）

概述

原理

Lipid Droplet Assay Kit-Blue试剂货号：LD05 脂滴荧光检测（蓝色）

1) T. Fujimoto et al., “Lipid droplets: a classic organelle with new outfits.” Histochem Cell Biol., 2008, 130(2), 263.

2) R. Singh et al., “Autophagy regulates lipid metabolism.” Nature, 2009, 458(7242), 1131.

3) M. Yokoyama et al., “Inhibition of endothelial p53 improves metabolic abnormalities related to dietary obesity.” Cell Reports, 2014, 7(5), 1691.

特点

特点1：定量专用试剂盒

试剂盒包含所需的工作液和缓冲液、可以简便实现定量脂滴。

Lipid Droplet Assay Kit-Blue试剂货号：LD05 脂滴荧光检测（蓝色）

特点2：大幅度缩短操作，活细胞也可以使用

Lipid Droplet Assay Kit-Blue试剂货号：LD05 脂滴荧光检测（蓝色）

实验例

实验例1：孔板检测实验例

Lipid Droplet Assay Kit-Blue试剂货号：LD05 脂滴荧光检测（蓝色）

<检测条件>

Blue：Ex: 376 – 386 nm、 Em: 435 – 455 nm

Deep Red ：Ex: 623 – 633 nm、 Em: 649 – 669 nm

实验例2：流式细胞术的实验例

Lipid Droplet Assay Kit-Blue试剂货号：LD05 脂滴荧光检测（蓝色）

< 检测条件>

Blue：Ex: 405 nm、 Em: 425 – 475 nm

Deep Red ：Ex: 640 nm、 Em: 650 – 670 nm

脂肪滴产品选择指南

	产品名称	规格	货号
成像(成像) 脂滴荧光探针	Lipi-Blue	10 nmol	LD01
	Lipi-Green	10 nmol	LD02
	Lipi-Red	100 nmol	LD03
	Lipi-Deep Red	10 nmol	LD04
定量（荧光酶标仪，FCM）脂滴荧光检测试剂盒	Lipid Droplet Assay Kit – Blue	1 set	LD05
定量（荧光酶标仪，FCM）脂滴荧光检测试剂盒	Lipid Droplet Assay Kit – Deep Red	1 set	LD06

参考文献

1. Fujimoto,T.et al., “Lipid droplets: a classic organelle with new outfits”Histochem Cell Biol., 2008, 130(2), 263.

2. Singh,R.et al., “Autophagy regulates lipid metabolism”Nature, 2009, 458(7242), 1131.

3. Yokoyama, M.et al., “Inhibition of endothelial p53 improves metabolic abnormalities related to dietary obesity”Cell Reports, 2014, 7(5), 1691.

4. Oka, M.et al., “Exogenous Cytokine-Free Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Classical Brown Adipocytes”, Cells., 2019, 8, (4), 373.

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日本同仁化学α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric货号：K261 α-酮戊二酸(α-KG)检测试剂盒(荧光法)- DOJINDO

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α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric货号：K261

α-酮戊二酸(α-KG)检测试剂盒(荧光法)

α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric

商品信息

储存条件：0-5度保存

运输条件：常温

特点：

● 检测结果的重现性好

● 可作为线粒体活性的指标

● 多角度了解细胞代谢变化

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100tests

现货

α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric货号：K261 α-酮戊二酸(α-KG)检测试剂盒(荧光法)

产品解说

规格性状

产品概述

检测原理

检测操作

标准曲线的作成例

实验例

常见问题Q&A

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规格性状

100 tests

・Fluorescent Dye
・α-KG Standard
・Enzyme Mix
・Coenzyme
・Assay Buffer
・lysis Solution
・Control Buffer
・ALT Solution
・Reaction Buffer

×1
300 μl×1
×1
×1
6.5 ml×1
2 ml×1
25 ml×1
35 μl×1
5 ml×1

产品概述

α-酮戊二酸(α-KG)是TCA循环中重要的中间体。它被作为进入TCA循环的葡萄糖代谢物增加的指标以及谷氨酰胺代谢(Glutaminolysis,一种谷氨酰胺底物与α-KG反应的通路)增加的指标。α-KG在神经递质谷氨酸和γ-氨基丁酸（GABA）的产生中起着重要作用，不仅如此它还担负着一定的清除细胞内的活性氧的功能，是非常重要的细胞代谢指标之一。

检测原理

α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric可以定量检测α-酮戊二酸(α-KG)。通过检测反应生成的试卤灵(Resorufin)的荧光(Ex：530 – 560 nm、Em：580 – 600 nm)对细胞内的α-KG进行定量。另外，本试剂盒还可以通过使用96孔板进行多样品检测。

α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric货号：K261 α-酮戊二酸(α-KG)检测试剂盒(荧光法)

检测操作

整个操作过程，从细胞的前处理到荧光酶标仪检测，只需要按照操作说明书的步骤添加试剂即可检测细胞内α-酮戊二酸(α-KG)的浓度。而且，本试剂盒专门针对同类型检测方法中普遍存在的结果重现性差的问题进行了优化，即使是第一次做α-KG检测实验的科研人员也可以放心使用。

► 结果重现性高的两个秘诀

1) 样品的前处理

α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric货号：K261 α-酮戊二酸(α-KG)检测试剂盒(荧光法)

同类型的检测试剂盒在样品前处理时需要微量的pH调节、过滤膜过滤等操作，这是导致结果重现性差的原因之一。而同仁化学研究所的α-KG检测试剂盒，只需要按照说明书添加试剂，可以大幅减少前处理过程中产生的操作误差。

2) α-Ketoglutarate的检测

α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric货号：K261 α-酮戊二酸(α-KG)检测试剂盒(荧光法)

其他检测试剂盒使用与上图相同的原理，但是由于①和②的两步反应同时在96孔板里进行，这是造成误差的另一个重要原因。而同仁化学研究所的试剂盒将这两步反应分开进行，进一步降低了误差。

标准曲线的作成例

本试剂盒附带α-KG的标准品，可以通过制作标准曲线来定量的检测样品中的α-KG浓度。如果样品中的α-KG浓度高于20 μmol/l，请预先稀释样品再检测。

α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric货号：K261 α-酮戊二酸(α-KG)检测试剂盒(荧光法)

实验例

Doxorubicin(DOX)刺激引起的细胞内代谢变化

阿霉素(Doxorubicin, DOX)可以作用于细胞周期的G2/M期，停止细胞的增殖并且细胞衰老，利用DOX作用于A549细胞，会导致胞内α-KG浓度增加。另外通过SG 03 Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal检测细胞衰老、C548 Cell Cycle Assay Solution Deep Red / C549 Cell Cycle Assay Solution Blue检测细胞周期、MT09 JC-1 MitoMP Detection Kit检测线粒体膜电位的结果如下：

α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric货号：K261 α-酮戊二酸(α-KG)检测试剂盒(荧光法)

Sulfasalazine(SSZ)引起的细胞内代谢变化

Sulfasalazine(SSZ)可以抑制细胞的胱氨酸/谷氨酸转运体(xCT)。用SSZ刺激A549细胞后，细胞内的α-KG、ATP、GSH、细胞放出的谷氨酸等变化用下列方法进行了检测。结果发现，SSZ刺激后细胞内的ATP、谷胱甘肽(GSH)、谷氨酸的放出量均减少，而细胞内的α-KG和ROS水平增加。 α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric货号：K261 α-酮戊二酸(α-KG)检测试剂盒(荧光法)

<使用产品>

・细胞内ATP：CK18 Cell Counting Kit-Luminescence

・细胞内GSH：G263 GSSG/GSH Quantification Kit II

・细胞内ROS：R252 ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-

・胞外谷氨酸：G269 Glutamate Assay Kit-WST

<实验条件>

细胞：A549细胞(1 x 106 cells) 暴露时间： 48 h

α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric货号：K261 α-酮戊二酸(α-KG)检测试剂盒(荧光法)

参考文献) Shogo Okazaki et al., “Glutaminolysis-related genes determine sensitivity to xCT-targeted therapy in head and neck squamous cell carcinoma”. Cancer Sci., 2019, doi:10.1111/cas.14182.

NASH诱导小鼠的肝脏组织的代谢变化

NASH(非酒精性脂肪肝)的病变组织中有ATP、α-KG、NAD的量减少的特点。使用4周龄的高脂肪食物投喂(引发NASH)的1型糖尿病模型小鼠(STAM模型)的肝脏组织，检测其中的ATP、α-KG、NAD水平的变化。结果显示，NASH诱导后10周龄的小鼠组中ATP、α-KG、NAD的浓度降低。

α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric货号：K261 α-酮戊二酸(α-KG)检测试剂盒(荧光法)

※详细的实验步骤请参考FAQ“是否有检测组织的实验例

<使用产品>

・组织内ATP：CK18 Cell Counting Kit-Luminescence

・组织内NAD：N509 NAD/NADH Assay Kit-WST

<实验参考文献>

ATP	Francesco Bellanti, et al., “Synergistic interaction of fatty acids and oxysterols impairs mitochondrial function and limits liver adaptation during nafld progression”, Redox Biology, 2018, 15, 86-96.
α-KG	Jianjian Zhao, et al., “The mechanism and role of intracellular α-ketoglutarate reduction in hepatic stellate cell activation”, Bioscience Reports, 2020, 40, (3).
α-KG	Ali Canbay, et al., “L‑Ornithine L‑Aspartate (LOLA) as a Novel Approach for Therapy of Non‑alcoholic Fatty Liver Disease”, Drugs, 2019, 79, 39-44.
NAD	Jinhan He, et al., “Activation of the Aryl Hydrocarbon Receptor Sensitizes Mice to Nonalcoholic Steatohepatitis by Deactivating Mitochondrial Sirtuin Deacetylase Sirt3”, Mol. and Cell. Biol., 2013, 33, (10), 2047-55.

常见问题Q&A

Q1：每个试剂盒可以检测所少个样品？

A1：如果标准曲线和样品都采用3个复孔来计算，可以检测12个样品。具体的96孔板的样品孔排列实例请见说明书。

Q2：是否可以用黑色孔板以外的孔板（透明板或白色板）？

A2：用透明板或白色板无法准确的绘制标准曲线，请使用黑色96孔板进行实验

Q3：检测时样品没有显色，可能的原因有哪些？

A3：本试剂盒对α-KG的检测范围是0.2 μmol/l以上，样品中的α-KG浓度如果低于0.2 μmol/l无法检测出来。可以尝试降低样品前处理时的稀释倍率。

Q：配置好的Working Solution能否保存？

A：配置好的Working solution无法保存，请现配现用。另外，Working solution遇光不稳定，配制好后请用铝箔纸包裹避光。※避光、室温的条件下可保存2小时左右。

Q：检测样品是否可以保存？

A：操作说明书上的“—定量细胞内α-KG的样品制备—”的步骤5中得到的前处理样品在-20℃可以保存10天。冷冻保存后的样品会发生沉淀，请离心后取上清作为检测样品。※加入20 μl Lysis solution, 吹打混匀后8,000xg离心10 min，取上清。

Q：是否有组织样品的检测实例？

A：有小鼠肝脏组织的检测实例。

具体的实验步骤如下：

碱性提取法提取的肝脏样品中的代谢指标检测

1.取大约100 mg小鼠肝脏组织样品加至500μl预冷的0.5 mol/ KOH水溶液中。

※必须使用经过灌流操作完全脱血的组织样品，否则残留的血液会影响检测结果。

2.用Dounce型组织研磨器研磨肝脏组织。

3.将研磨后的样品回收至微管中，用500μl预冷的0.5 mol/ KOH水溶液清洗研磨器，并将清洗后的液体也

一起转移到回收样品的微管中(共约1 ml)。

4.向回收样品的微管中加入1 ml预冷的超纯水，充分混合后在冰浴上静置5 min(共约2 ml)。

※由于溶液的粘性较高，有时会出现离心后难以分离的情况。此时，用25 g左右的细针头注射器不断

吸取/推出(大约20-30次)，直到可以顺畅的吹打溶液为止。

5.离心机12,000xg，4 ℃离心5 min。

α-KG检测用样品的制备

6.取900μl上一步操作(步骤5)得到的溶液，加入200μl 1mol/l KH2PO4水溶液进行中和，混匀后在冰浴上

静置5 min。

7.离心机12,000xg，4 ℃离心5 min，取1 ml上清液至新的微管中作为检测样品。

<检测时的注意事项>

※组织提取的样品无法保存，请在当天内完成检测。

※枪头中残留的样品溶液时造成误差的原因之一，吸取样品溶液时尽量缓慢，减少枪头中残留的样品溶液。

※在稀释标准品和样品的时候，使用0.5 mol/l KOH水溶液和1mol/l KH2PO4水溶液按照9:5比率混合的溶液。

<检测实例>

诱导非酒精性脂肪肝的小鼠肝脏组中α-KG量的变化

α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric货号：K261 α-酮戊二酸(α-KG)检测试剂盒(荧光法)

日本同仁化学Lactate Assay Kit-WST试剂盒货号：L256 乳酸检测试剂盒- DOJINDO

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Lactate Assay Kit-WST试剂盒货号：L256

乳酸检测试剂盒

Lactate Assay Kit-WST

商品信息

储存条件：0-5度保存，避光

运输条件：室温

特点：

● 细胞上清液和细胞样品均适用

● 操作简便

● 灵敏度高最低可检测到0.02 mmol/l的乳酸

● 试剂稳定性高

● 享有显色底物WST专利

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葡萄糖乳酸检测

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代谢检测方案

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原理

特点

乳酸标准曲线

实验例

常见问题Q&A

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试剂盒内含

Lactate Assay Kit-WST试剂盒货号：L256 乳酸检测试剂盒

概述

乳酸是细胞的一种主要代谢途径-糖酵解的代谢产物，也是肌肉疲劳和高乳酸血症的重要生物标志物。它还可以作为监测细胞内代谢途径变化的标志物。此外最近的代谢研究表明，乳酸是组织和癌细胞的三羧酸循环中碳的主要来源。

Lactate Assay Kit-WST^®可用于定量检测糖酵解代谢产生的乳酸，并优化了定量过程。本试剂盒通过测定WST^®的显色反应来定量细胞上清液中的乳酸含量，可用96孔板检测，灵敏度高，最低可检测到0.02 mmol/l的乳酸。

WST^®：WST是日本同仁化学研究所的注册商标

原理

本试剂盒通过测定WST的显色反应来定量细胞上清或细胞内的乳酸含量。

另外，试剂盒中含有乳酸标准液，可以通过制备标准曲线来定量样品中的乳酸浓度。

Lactate Assay Kit-WST试剂盒货号：L256 乳酸检测试剂盒

特点

特点1：操作简单，只需要加入试剂

只需在加入细胞裂解液的细胞上清液中加入试剂，培养即可。

Lactate Assay Kit-WST试剂盒货号：L256 乳酸检测试剂盒

特点2：试剂稳定性高

Lactate Assay Kit-WST试剂盒货号：L256 乳酸检测试剂盒

乳酸标准曲线

可以从使用试剂盒中的乳酸标准液制作出乳酸标准曲线，然后通过标准曲线求出样品中的乳酸浓度。

当乳酸浓度在1 mmol/l以上时，可以通过稀释样品进行检测。

Lactate Assay Kit-WST试剂盒货号：L256 乳酸检测试剂盒

实验例

2-脱氧-D-葡萄糖对糖酵解的抑制作用

1、在96孔板中接种1×10⁴个/孔的HeLa细胞(MEM培养基中含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素)，在37℃，5% CO₂培养箱中过夜培养。

2、去除上清液后，在培养基中加入100 µl配制好的系列浓度的2-脱氧-D-葡萄糖溶液。

3、在37℃，5% CO₂培养箱中过夜培养。

4、培养后，吸取20 µl细胞上清液至1.5 ml微量管中，并用超纯水稀释8倍制备样品溶液，然后按照说明书的图3在每孔中加入20 µl样品溶液。

5、按照“配制乳酸标准液”的方法配制乳酸标准液。

6、在96孔板中按照说明书的图3在每孔中加入20 µl各种浓度的乳酸标准液。

7、在每孔中加入80 µl工作液。

8、在37℃培养箱中培养30 min。

9、用酶标仪测定450 nm的吸光度，并用标准曲线计算样品的乳酸浓度。

Lactate Assay Kit-WST试剂盒货号：L256 乳酸检测试剂盒

2-脱氧-D-葡萄糖对糖酵解的抑制作用，随着2-脱氧-D-葡萄糖 (一种糖酵解抑制剂)浓度的增加，乳酸浓度逐渐减少

葡萄糖和乳酸的测定例

用葡萄糖测定试剂盒（货号：G264）和乳酸测定试剂盒检测（货号：L256）:检测将葡萄糖转运蛋白抑制剂Phloretin添加到Jurkat细胞时的代谢活性变化。

Lactate Assay Kit-WST试剂盒货号：L256 乳酸检测试剂盒

■实验条件

细胞：Jurkat细胞（5×10⁵细胞）

药物：Phloretin（终浓度：100 µmol/l）

培养时间：过夜培养

■结果

Phloretin的添加抑制了葡萄糖的摄取，减少了葡萄糖的消耗，增加了培养基中葡萄糖的量，并减少了乳酸的量。

常见问题Q&A

Q：使用含有血清的培养基，可以测定培养上清液中的乳酸吗？

A：使用含有血清的培养基，可以测定培养上清液中的乳酸。
但是在含有血清的情况下，由于背景上升，需要测定培养基OD值并将其作为背景对照减去。
【参考数据】
含和不含10％FBS的吸光度比较

Lactate Assay Kit-WST试剂盒货号：L256 乳酸检测试剂盒

<结果>
在培养基中加入10％FBS的组吸光度大大升高，因此需要测定培养基作为背景对照。

Q：如何检测细胞内乳酸含量？

（1）用微量管收集1×10⁵的细胞^*1。

（2）以300×g离心2 min后去除上清液。

（3）加入300 μl的PBS，用移液器吹打使其重悬，再以300×g离心2 min后去除上清液。
（4）加入300 μl细胞裂解液^*2（0.1％Triton-X）并涡旋1 min，制成细胞裂解液。

（5）以8000×g离心5 min，收集上清液。
（6）将步骤（5）所得溶液用超滤离心管（PALL，No.OD010C3，滤膜分子量：10K）以12,000×g 离心10 min^*3去除蛋白质，得到待测样品。

*1、样品为HeLa细胞时，为了检测出0.02 mmol/l以上的乳酸含量，需要1×10⁵的细胞甚至更多。
*2、如果细胞裂解液中含有SDS会抑制显色，因此不要使用含有SDS的缓冲液。

*3、内源性乳酸脱氢酶（LDH）会导致背景增高，因此通过脱蛋白处理去除内源性乳酸脱氢酶

（LDH）。
※测定样品设定为3个复孔时（n=3），合计至少需要60 μl以上（每孔20 μl×3）。
※如果过滤后滤液不足60 μl，可适当延长过滤时间。
※稀释细胞裂解液至合适的浓度，使结果在标准曲线范围内（0-1 mmol/l）。

Q：配制后的Working Solution稳定性如何，可以保存多久？

A：Working Solution需要现配现用。
光会影响Working Solution的稳定性，所以配制后请用铝箔纸包裹。
配制后的Working Solution在室温避光条件下可以保存4 h。
（Working Solution遇到光，溶液的颜色会由红色变为橙色，背景会升高。）

Q：为什么我的样品孔没有显色？

A：样品中的乳酸浓度可能低于检测限（0.02 mmol/l）。
乳酸浓度低于0.02 mmol/l的样品无法用该试剂盒检测，因此请考虑其他方法，如LC-MS。
如果待测样品被稀释，则稀释样品中含有的乳酸浓度可能低于0.02 mmol/l。
请降低稀释比例，从而将检测样品的乳酸浓度调整到最低检测限以上。

Q：是否可以检测含有还原性物质的样品？

A：如果样品中含有还原性的物质，则WST染料也会发生显色，此时无法准确定量乳酸浓度。
实验中如遇到以上情况，可以设定药物对照（不含细胞含药物的培养基+试剂），
并将标准品孔和样品孔的吸光度分别减去药物对照的吸光度。

Q：该试剂盒可以定量D-Lactate吗？

A：该试剂盒是用于L-Lactate的定量，不能定量D-Lactate。

Q：是否可以使用450 nm以外波长的滤光片进行检测？

A：也可以使用490 nm的滤光片，但是吸光度会低于在450 nm处的吸光度。

Q：一个试剂盒可以检测样品的数量。

A：制备标准曲线和样品（n=3）时，可以检测的样品数量如下所示。

Lactate Assay Kit-WST试剂盒货号：L256 乳酸检测试剂盒

标准曲线：8个点(0, 0.0157, 0.0313, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1 mmol/l)(n=3)

Lactate Assay Kit-WST试剂盒货号：L256 乳酸检测试剂盒

96孔板排列示意图（n=3）

参考文献

编号	文献名	年分	IF
1	Hypoxia-induced exosomal circPDK1 promotes pancreatic cancer glycolysis via c-myc activation by modulating miR-628-3p/BPTF axis and degrading BIN1	2022	23.2
2	Serine racemase enhances growth of colorectal cancer by producing pyruvate from serine	2020	19.9
3	YAP mediates compensatory cardiac hypertrophy through aerobic glycolysis in response to pressure overload	2022	19.5
4	Serine racemase enhances growth of colorectal cancer by producing pyruvate from serine, Nature Metabolism,2020, 2,81–96	2020	13.5
5	Polymer-conjugated glucosamine complexed with boric acid shows tumor-selective accumulation and simultaneous inhibition of glycolysis, Biomaterials,2021, 269:120631	2020	12.8
6	Metabolome Analysis Reveals Excessive Glycolysis via PI3K/AKT/mTOR and RAS/MAPK Signaling in Methotrexate-Resistant Primary CNS Lymphoma-Derived Cells, Clinical Cancer Research,2020, 26(11):2754-2766	2020	11.2
7	Inhibition of glycolytic activator PFKFB3 suppresses tumor growth and induces tumor vessel normalization in hepatocellular carcinoma	2021	9.8
8	Epigenetic silencing of LncRNA LINC00261 promotes c-myc-mediated aerobic glycolysis by regulating miR-222-3p/HIPK2/ERK axis and sequestering IGF2BP1	2021	8.8
9	PLEKHA5 regulates the survival and peritoneal dissemination of diffuse-type gastric carcinoma cells with Met gene amplification, Oncogenesis,2021, 10(3):25	2021	7.5
10	An iPSC-based neural model of sialidosis uncovers glycolytic impairment-causing presynaptic dysfunction and deregulation of Ca2+ dynamics	2021	7.1
11	Tumor cell-derived angiopoietin-like protein 2 establishes a preference for glycolytic metabolism in lung cancer cells,Cancer Science,2020, 111(4):1241-1253	2020	6.7
12	Tumor cell-derived angiopoietin-like protein 2 establishes a preference for glycolytic metabolism in lung cancer cells	2020	6.5
13	Sodium-Glucose Co-Transporter 2 Inhibitors Correct Metabolic Maladaptation of Proximal Tubular Epithelial Cells in High-Glucose Conditions	2020	6.2
14	Metabolites Produced by a New Lactiplantibacillus plantarum Strain BF1-13 Isolated from Deep Seawater of Izu-Akazawa Protect the Intestinal Epithelial Barrier from the Dysfunction Induced by Hydrogen Peroxide	2022	6.1
15	MicroRNA-505, Suppressed by Oncogenic Long Non-coding RNA LINC01448, Acts as a Novel Suppressor of Glycolysis and Tumor Progression Through Inhibiting HK2 Expression in Pancreatic Cancer	2021	6.1
16	Matrine Promotes Human Myeloid Leukemia Cells Apoptosis Through Warburg Effect Mediated by Hexokinase 2, Frontiers in Pharmacology,2019, 10:1069	2019	5.8
17	Mutant KRAS drives metabolic reprogramming and autophagic flux in premalignant pancreatic cells	2021	5.8
18	Long Non-Coding RNA TMPO-AS1 Promotes GLUT1-Mediated Glycolysis and Paclitaxel Resistance in Endometrial Cancer Cells by Interacting With miR-140 and miR-143	2022	5.7
19	Circ_0002111/miR-134-5p/FSTL1 signal axis regulates tumor progression and glycolytic metabolism in papillary thyroid carcinoma cells	2022	5.5
20	SIRT3-Mediated SOD2 and PGC-1α Contribute to Chemoresistance in Colorectal Cancer Cells, Annals of Surgical Oncology,2021, 28(8):4720-4732	2021	5.3
21	Metabolic changes in synovial cells in early inflammation: Involvement of CREB phosphorylation in the anti-inflammatory effect of 2-deoxyglucose	2021	4.1
22	Novel pharmacological effects of poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor rucaparib on the lactate dehydrogenase pathway, Biochemical and Biophysical Research Communications,2019, 510(4):501-507	2019	3.6
23	Neopetrosidines A–D, pyridine alkaloids isolated from the marine sponge Neopetrosia chaliniformis and their cell cycle elongation activity	2021	3.5
24	Novel pharmacological effects of poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor rucaparib on the lactate dehydrogenase pathway	2019	3.3
25	Circ_0000442 functions as a tumor repressor in breast cancer by impacting miR-1229-3p and upregulating ZBTB1	2020	2.5
26	Suppressive Effects of Anisomycin on the Proliferation of B16 Mouse Melanoma Cells In Vitro	2021	2.1
27	Liver-Inspired Polyetherketoneketone Scaffolds Simulate Regenerative Signals and Mobilize Anti-Inflammatory Reserves to Reprogram Macrophage Metabolism for Boosted Osteoporotic Osseointegration	2023	15.1
28	Arresting calcium-regulated sperm metabolic dynamics enables prolonged fertility in poultry liquid semen storage	2023	4.6
29	Exosomes secreted by ST3GAL5high cancer cells promote peritoneal dissemination by establishing a premetastatic microenvironment	2023	6.6

日本同仁化学Glucose Assay Kit-WST试剂盒货号：G264- DOJINDO

发表于2024年6月19日由whatman中国官网

上海金畔生物科技有限公司代理日本同仁化学 DOJINDO代理商全线产品，欢迎访问官网了解更多信息

Glucose Assay Kit-WST试剂盒货号：G264

葡萄糖检测试剂盒

Glucose Assay Kit-WST

商品信息

储存条件：0-5度保存，避光防潮

运输条件：室温

特点：

● 细胞上清液和细胞样品均适用

● 稳定性好

●可使用酶标仪高通量筛选

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葡萄糖乳酸检测

选择规格：

50 tests

200 tests

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代谢

Glucose(葡萄糖)摄取能力检测试剂盒

产品解说

活动进行中

试剂盒内含

概述

原理

操作步骤

制作葡萄糖标准曲线

实验例

常见问题Q&A

参考文献

产品解说

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凑单关联产品TOP5

NO.1. Lactate Assay Kit-WST 乳酸检测

NO.2. Glucose Uptake Probe-Green 葡萄糖摄取检测

NO.3. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测

NO.4. FerroOrange 细胞亚铁离子检测

NO.5. Liperfluo 细胞脂质过氧化物检测

试剂盒内含

	50 tests	200 tests
Dye Mixture	×1	×1
葡萄糖标准品（10 mmol/l）(红盖)	150 μl×1	600 μl×1
酶(绿盖)	×1	×1
Assay Buffer	3.5 ml×1	14 ml×1
Reconstitution Buffer(蓝盖)	350 μl×1	1.4 ml×1

概述

葡萄糖是一种提供体内能量来源的最重要的物质，也是一种主要能量代谢指标。它不仅是糖尿病和肥胖研究的糖代谢指标，在癌症研究中，也常和乳酸一起作为体内细胞代谢的检测指标。最新的研究表明，抑制与葡萄糖代谢和脂质代谢有关的酶的活性，可以抑制癌细胞的生长。

葡萄糖检测试剂盒（Glucose Assay Kit-WST）可以定量检测能量代谢的底物-葡萄糖，通过测定WST反应的吸光度来定量细胞培养基上清液中的葡萄糖。检测限可达浓度为0.02 mmol/l的葡萄糖，适合用96孔板检测，可以同时检测多个样品。

原理

*本试剂盒可以检测细胞上清液^＊的葡萄糖的含量，通过检测WST甲赞的吸光度来测定。另外，试剂盒里有葡萄糖标准液，可以制作标准曲线，测定样品中的葡萄糖浓度。

Glucose Assay Kit-WST试剂盒货号：G264

*要测定细胞上清液以外的样品，请事先查看常见问题FAQ“是否有检测细胞上清液以外的实验例?”。

操作步骤

Glucose Assay Kit-WST试剂盒货号：G264

制作葡萄糖标准曲线

可以用试剂盒中的葡萄糖标准液制作出葡萄糖标准曲线，然后通过标准曲线求出样品中的葡萄糖浓度。当葡萄糖浓度在0.5 mmol/l以上时，可以通过稀释样品进行检测。

Glucose Assay Kit-WST试剂盒货号：G264

实验例

用Phloretin抑制葡萄糖的摄取

1. 制备所需浓度Phloretin的Jurkat细胞悬液 (5×10⁵ cells/ml，在RPMI培养基中含有10%的胎牛血清和1%的青霉素-链霉素)。

2. 在6孔板中接种1×10⁶ cells/孔的细胞悬液，在37℃，5% CO₂培养箱中过夜培养。

3. 将细胞悬液转移到锥形管中，在1,500 rpm离心5 min。

4. 吸取100 µl上清液至1.5 ml微型管中，用超纯水稀释30倍。

5. 按照葡萄糖标准液的制备方法制备葡萄糖标准液。

6. 在96孔板中分别加入50 µl的样品或葡萄糖标准液。

7. 在每孔中加入50 µl工作液。

8. 在37℃培养箱中培养30 min。

9. 用酶标仪检测450 nm处的吸光度，根据葡萄糖的标准曲线计算样品的葡萄糖浓度。

Glucose Assay Kit-WST试剂盒货号：G264

Phloretin抑制葡萄糖的摄取

实验证实，细胞培养基上清液中的葡萄糖摄入量减少与Phloretin (一种葡萄糖转运抑制剂)浓度之间有依存关系。

常见问题Q&A

Q1：是否可以检测2-Deoxy-D-glucose？

A1：可以检测2-Deoxy-D-glucose。

Q2：Working Solution的稳定性如何？

A2：Working Solution无法保存，请现配现用。由于对光不稳定，因此配制后请避光，在室温和避光条件下可保存4小时（当Working Solution在曝光下，溶液颜色会由红色变为橙色，背景升高）。

Q3：当有还原性物质存在时是否还可以用这个试剂盒检测？

A3：如果样品中含有还原性的物质，则也会和WST染料发生显色，此时无法准确定量葡萄糖浓度。实验中如遇到以上情况，可以设定药物对照（不含细胞含药物的培养基+试剂）作为背景对照，并从标准曲线和样品的吸光度中减去它。

Q4：是否有检测细胞上清液以外的实验例?

A4：有测定细胞内葡萄糖的实验例。操作详情，请参考常见问题FAQ“Q5”。其他的样品没有实验例。

Q5：是否可以检测细胞内葡萄糖？

A5：细胞内葡萄糖也可以检测，请参考下面的样品制备步骤。

请准备「0.1%Triton X-100水溶液」和「滤膜（分子量：10KD ）」

（1）将细胞^*1悬液收于1.5 ml微量管中。

※测定所需的细胞数，需要根据细胞种类进行调整。
HepG2细胞和Jurkat细胞的测量结果如下图所示
（2）在300×g下离心5分钟，去除上清液。
(3)加入300 µl PBS，重悬细胞，在300×g下离心5分钟，除去上清液。
(4)加入250 µl细胞溶解液^*2(0.1%Triton-X)，裂解细胞后，在12,000×g离心5分钟。
(5)将操作(4)的上清液200 µl转移到超滤膜过滤管(分子量：10K)中，以12,000×g离心10分钟。
※当测定样品为n=3时，总共需要150 µl以上(50 µl×3)。
※离心后的滤液不超过150 µl时，请延长离心时间。
(6)将通过操作(5)得到的滤液作为测定样品。
然后按照使用说明书，测定葡萄糖浓度。
※测定试样在标准曲线范围内(0-0.5 mmol/l)内，请适当用细胞溶解液稀释，用于测定。
*1 为了检测0.02 mmol/l以上的葡萄糖，HepG2细胞数量为1×10⁵cells以上，Jurket细胞需要2×10⁶ cells以上的细胞数量。
*2 细胞溶解液中含有SDS会抑制显色，因此不能使用含有SDS的缓冲液。

Q6:一个试剂盒可以检测样品的数量。

A6：制备标准曲线和样品（n=3）时，可以检测的样品数量如下所示。

Glucose Assay Kit-WST试剂盒货号：G264

标准曲线：8个点(0, 0.0157, 0.0313, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1 mmol/l)(n=3)

Glucose Assay Kit-WST试剂盒货号：G264

96孔板排列示意图（n=3）

Q7:可以测量L-Glucose吗？

A7：本产品用于β-D-Glucose测量，不能测量L-Glucose。

参考文献

No	检测对象	文献
1	小鼠血清	Increased levels of Aβ42 decrease the lifespan of ob/ob mice with dysregulation of microglia and astrocytes, FASEB J., 2019,DOI: 10.1096/fj.201901028RR
2	链霉菌	Enhancement of metabolic flux toward ε-poly-l-lysine biosynthesis by targeted inactivation of concomitant polyene macrolide biosynthesis in Streptomyces albulus, J. Biosci.Bioeng., 2020,DOI: 10.1016/j.jbiosc.2019.12.002
3	HCT116细胞	Serine racemase enhances growth of colorectal cancer by producing pyruvate from serine, Nat. Metab., 2020, 2(1), 81
4	P388白血病细胞	2-Deoxy-D-glucose enhances the anti-cancer effects of idarubicin on idarubicin-resistant P388 leukemia cell, Oncol. Lett., 2020, 20(1), 962-966
5	小鼠精子细胞	Macrophage ubiquitin‑specific protease 2 contributes to motility, hyperactivation, capacitation, and in vitro fertilization activity of mouse sperm, Cellular and Molecular Life Sciences, 2020, doi: 10.1007/s00018-020-03683-9

*要测定细胞培养上清液以外的样品，请事先查看常见问题FAQ“是否有除检测细胞上清液以外的样品检测实验例”。

日本同仁化学Glycolysis/JC-1 MitoMP Assay Kit货号：G272- DOJINDO

发表于2024年6月18日由whatman中国官网

上海金畔生物科技有限公司代理日本同仁化学 DOJINDO代理商全线产品，欢迎访问官网了解更多信息

Glycolysis/JC-1 MitoMP Assay Kit货号：G272

糖酵解(乳酸生成量)和线粒体膜电位(JC-1)同时检测试剂盒

Glycolysis/JC-1 MitoMP Assay Kit

商品信息

储存条件：0-5度保存

运输条件：常温

特点：

● 一个样品同时检测两种指标

● 包含所有所需试剂

● 详细的操作步骤

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选择规格：

50testsA

现货

规格性状

产品概述

产品特点

检测原理

实验例

常见问题Q&A

规格性状

Glycolysis/JC-1 MitoMP Assay Kit货号：G272

产品概述

线粒体功能与细胞代谢之间的联系是众所周知的，对一系列疾病都有影响，包括癌症、衰老和神经退行性疾病。已经发现，衰老细胞通常依靠糖酵解系统生存，而不是利用线粒体能量来源。相反，即使糖酵解系统受到抑制，通常严重依赖糖酵解的癌细胞激活线粒体功能依然能确保其存活，。鉴于这些观察结果，越来越有必要研究线粒体功能和糖酵解途径，以增强我们对细胞内代谢改变的理解。我们的试剂盒允许测量乳酸产生（通过乳酸测定）以检测糖酵解系统的变化，以及线粒体膜电位（通过JC-1测定）以评估线粒体功能。该试剂盒的概念是提供来自同一样品的全面一站式检测，以跟踪细胞内代谢的变化并指导后续更详细的分析。该试剂盒包括检测所需的所有试剂，还提供组合方案。

Glycolysis/JC-1 MitoMP Assay Kit货号：G272

产品特点

任何刺激引起的细胞内代谢变化都可以通过测量乳酸产生和线粒体膜电位来检测。

在某些情况下，尽管细胞糖酵解系统或线粒体功能（能量产生的主要途径）受到损害，但细胞仍设法存活。据了解，这是因为细胞努力通过增强糖酵解来持续并防止细胞死亡，即使线粒体功能受损，或者在糖酵解受损时激活线粒体功能，同时监测糖酵解系统和线粒体功能。如下所述，可以深入了解细胞内发生的事情。

Glycolysis/JC-1 MitoMP Assay Kit货号：G272

同时测量同一样品

通过从单个样品中分离上清液和细胞，可以同时测量线粒体膜电位（JC-1测定）和乳酸产生。详细的测量方法在说明书中描述。

Glycolysis/JC-1 MitoMP Assay Kit货号：G272

检测原理

该试剂盒包括乳酸检测试剂盒，旨在通过测量WST甲臜吸光度来检测细胞培养基中的乳酸产生。此外，它还具有JC-1染料，用于使用荧光测量检测细胞内的线粒体膜电位。使用酶标仪在同一样品上轻松定量这两个靶标，便于评估代谢变化。

Glycolysis/JC-1 MitoMP Assay Kit货号：G272

实验例

用糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）处理的HeLa细胞的细胞内代谢变化

当我们使用CCK-8*测定法评估8-DG处理的HeLa细胞的细胞活力时，我们观察到活力的微小变化。然而，鉴于观察到乳酸产生的减少，它促使我们质疑尽管糖酵解系统受到抑制，如何维持细胞活力。为了回答这个问题，我们使用JC-1测定法检查了线粒体膜电位。这项研究的结果表明，当糖酵解系统被2-DG抑制时，HeLa细胞通过增强线粒体功能来维持其存活。

※ 细胞计数试剂盒-8（产品代码：CK04）不包含在本试剂盒中。

Glycolysis/JC-1 MitoMP Assay Kit货号：G272

常见问题Q&A

Q:每个试剂盒可以检测多少样品？

A:【乳酸测定】按每个样品3个复孔计算，您可以检测到如下样品数量

Glycolysis/JC-1 MitoMP Assay Kit货号：G272

*如果样品的乳酸浓度未知，请进行预实验，以确定稀释比例，使其低于1 mmol/l乳酸标准溶液的吸光度。请参照说明书中“检测样品的制备”。

*进行预实验或不进行预实验时，可检测的最大样品数详见以上表格。

*进行乳酸测定时，如培养基含有血清，建议制备一个含血清的培养基的测量样品，作为背景对照。

Glycolysis/JC-1 MitoMP Assay Kit货号：G272

乳酸测定的孔板设置示例（n = 3）

（左：无预实验，右：预实验）

【JC-1 检测】

Glycolysis/JC-1 MitoMP Assay Kit货号：G272

※ 本试剂盒，至少可使用96孔板检测48个孔。

Q: 使用此试剂盒进行乳酸检测和 JC-1 检测需要多长时间？

A: 实验流程和每次测定所需的时间（大约）如下图所示。

Glycolysis/JC-1 MitoMP Assay Kit货号：G272

Q: 【乳酸检测】是否可以先进行乳酸测定，然后在收集上清液后进行JC-1测定？

A: 如果首先进行乳酸测定，测量时间的差异可能会由于刺激条件的不同而影响结果。收集上清液后，请务必先进行JC-1测定。细胞培养上清液可冷冻（-20°C）保存1个月。

Q: 【乳酸检测】乳酸测定可以使用450 nm以外的波长进行测量吗？

A: 除了 450 nm 外，它还可与 490 nm 滤光片一起使用。但是，吸光度值会低于在450nm处测量时的值。 Glycolysis/JC-1 MitoMP Assay Kit货号：G272

Q: 【乳酸检测】乳酸测定可以测量含有还原性物质的样品吗？

A：如果样品中含有还原性物质，染料WST会变色，您可能无法准确测量乳酸的变化。如果您的检测物质中含有还原性物质，请准备一些只有待测物+培养基的孔【不含细胞】，作为背景对照。最后计算时，从标准曲线/样品吸光度结果中扣除以上背景对照。

Q：【乳酸检测】工作液稳定性如何？

A：工作液无法保存。请现配现用。另外，由于它对光不稳定，因此避光，工作液在室温避光条件下，可稳定保存4个小时。

一旦工作液未避光，则颜色会从红色变为橙色，从而导致背景的增加。

Q：【乳酸检测】细胞培养上清液样品可以保存吗？

A：可以冷冻（-20°C）储存1个月。

Q：【JC-1 检测】我可以使用含血清的培养基吗？

A：含血清的培养基可以在清洗细胞或制备JC-1工作液时使用，在荧光观察时，我们建议使用Imaging Buffer溶液，但如果一定要使用含血清的培养基，也建议使用无酚红的培养基。

Q：【JC-1检测】是否可以固定细胞？

A：不建议，由于线粒体固定后会发生去极化，因此染色后固定和固定后染色都是不可能的。

Q：【乳酸检测】检测到的样品的吸光度与空白孔的吸光度相同，原因和解决方案是什么？

A：原因可能是细胞释放的乳酸量低。首先，请增加要接种的细胞数量或进一步延长孵育时间。

Q：【JC-1检测】如何解释增加（或减少）红色和绿色的荧光值的结果？

A：计算每个药物处理后的样品和对照组的红色与绿色荧光值的比率。将两者进行比较，荧光比越低，线粒体膜电位越低。

【按红/绿比评估的原因】

由于JC-1以膜电位依赖性方式在细胞中积累，因此每个细胞的JC-1浓度可能因细胞的状态而变化^1），2）（由于细胞条件的不同，实验组和对照组的JC-1累积浓度不同）。

此外，当线粒体膜电位高时，JC-1聚集，其荧光从绿色变为红色。

JC-1累积的量则取决于膜电位^3）因此样品的线粒体膜电位变化可以通过红/绿比进行分析比较。

〈参考资料〉

1） A. Cossarizza， et al.， Biochem Biophys Res Commun.， 1993， 197（1）， 40.

2） A. Perelman， et al.， Cell Death and Disease， 2012， 3， e430.

3） S. T. Smiley， et al.， Proc. Nail. Acad. Sci.， 1991， 88， 3671.

日本同仁化学α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric货号：K261- DOJINDO

发表于2024年6月18日由whatman中国官网

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α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric货号：K261

α-酮戊二酸(α-KG)检测试剂盒(荧光法)

α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric

商品信息

储存条件：0-5度保存

运输条件：常温

特点：

● 检测结果的重现性好

● 可作为线粒体活性的指标

● 多角度了解细胞代谢变化

下载说明书

学习资料

选择规格：

100tests

现货

α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric货号：K261

规格性状

产品概述

检测原理

检测操作

标准曲线的作成例

实验例

常见问题Q&A

规格性状

100 tests

・Fluorescent Dye
・α-KG Standard
・Enzyme Mix
・Coenzyme
・Assay Buffer
・lysis Solution
・Control Buffer
・ALT Solution
・Reaction Buffer

×1
300 μl×1
×1
×1
6.5 ml×1
2 ml×1
25 ml×1
35 μl×1
5 ml×1

产品概述

检测原理

α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric货号：K261

检测操作

► 结果重现性高的两个秘诀

1) 样品的前处理

α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric货号：K261

2) α-Ketoglutarate的检测

α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric货号：K261

标准曲线的作成例

本试剂盒附带α-KG的标准品，可以通过制作标准曲线来定量的检测样品中的α-KG浓度。如果样品中的α-KG浓度高于20 μmol/l，请预先稀释样品再检测。

α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric货号：K261

实验例

Doxorubicin(DOX)刺激引起的细胞内代谢变化

α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric货号：K261

Sulfasalazine(SSZ)引起的细胞内代谢变化

<使用产品>

・细胞内ATP：CK18 Cell Counting Kit-Luminescence

・细胞内GSH：G263 GSSG/GSH Quantification Kit II

・细胞内ROS：R252 ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-

・胞外谷氨酸：G269 Glutamate Assay Kit-WST

<实验条件>

细胞：A549细胞(1 x 106 cells) 暴露时间： 48 h

α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric货号：K261

NASH诱导小鼠的肝脏组织的代谢变化

α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric货号：K261

※详细的实验步骤请参考FAQ“是否有检测组织的实验例

<使用产品>

・组织内ATP：CK18 Cell Counting Kit-Luminescence

・组织内NAD：N509 NAD/NADH Assay Kit-WST

<实验参考文献>

ATP	Francesco Bellanti, et al., “Synergistic interaction of fatty acids and oxysterols impairs mitochondrial function and limits liver adaptation during nafld progression”, Redox Biology, 2018, 15, 86-96.
α-KG	Jianjian Zhao, et al., “The mechanism and role of intracellular α-ketoglutarate reduction in hepatic stellate cell activation”, Bioscience Reports, 2020, 40, (3).
α-KG	Ali Canbay, et al., “L‑Ornithine L‑Aspartate (LOLA) as a Novel Approach for Therapy of Non‑alcoholic Fatty Liver Disease”, Drugs, 2019, 79, 39-44.
NAD	Jinhan He, et al., “Activation of the Aryl Hydrocarbon Receptor Sensitizes Mice to Nonalcoholic Steatohepatitis by Deactivating Mitochondrial Sirtuin Deacetylase Sirt3”, Mol. and Cell. Biol., 2013, 33, (10), 2047-55.

常见问题Q&A

Q1：每个试剂盒可以检测所少个样品？

A1：如果标准曲线和样品都采用3个复孔来计算，可以检测12个样品。具体的96孔板的样品孔排列实例请见说明书。

Q2：是否可以用黑色孔板以外的孔板（透明板或白色板）？

A2：用透明板或白色板无法准确的绘制标准曲线，请使用黑色96孔板进行实验

Q3：检测时样品没有显色，可能的原因有哪些？

A3：本试剂盒对α-KG的检测范围是0.2 μmol/l以上，样品中的α-KG浓度如果低于0.2 μmol/l无法检测出来。可以尝试降低样品前处理时的稀释倍率。

Q：配置好的Working Solution能否保存？

Q：检测样品是否可以保存？

Q：是否有组织样品的检测实例？

A：有小鼠肝脏组织的检测实例。

具体的实验步骤如下：

碱性提取法提取的肝脏样品中的代谢指标检测

1.取大约100 mg小鼠肝脏组织样品加至500μl预冷的0.5 mol/ KOH水溶液中。

※必须使用经过灌流操作完全脱血的组织样品，否则残留的血液会影响检测结果。

2.用Dounce型组织研磨器研磨肝脏组织。

3.将研磨后的样品回收至微管中，用500μl预冷的0.5 mol/ KOH水溶液清洗研磨器，并将清洗后的液体也

一起转移到回收样品的微管中(共约1 ml)。

4.向回收样品的微管中加入1 ml预冷的超纯水，充分混合后在冰浴上静置5 min(共约2 ml)。

※由于溶液的粘性较高，有时会出现离心后难以分离的情况。此时，用25 g左右的细针头注射器不断

吸取/推出(大约20-30次)，直到可以顺畅的吹打溶液为止。

5.离心机12,000xg，4 ℃离心5 min。

α-KG检测用样品的制备

6.取900μl上一步操作(步骤5)得到的溶液，加入200μl 1mol/l KH2PO4水溶液进行中和，混匀后在冰浴上

静置5 min。

7.离心机12,000xg，4 ℃离心5 min，取1 ml上清液至新的微管中作为检测样品。

<检测时的注意事项>

※组织提取的样品无法保存，请在当天内完成检测。

※枪头中残留的样品溶液时造成误差的原因之一，吸取样品溶液时尽量缓慢，减少枪头中残留的样品溶液。

※在稀释标准品和样品的时候，使用0.5 mol/l KOH水溶液和1mol/l KH2PO4水溶液按照9:5比率混合的溶液。

<检测实例>

诱导非酒精性脂肪肝的小鼠肝脏组中α-KG量的变化

α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric货号：K261

日本同仁化学NADP/NADPH Assay Kit-WST试剂盒货号：N510- DOJINDO

发表于2024年6月18日由whatman中国官网

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NADP/NADPH Assay Kit-WST试剂盒货号：N510

NADP/NADPH检测试剂盒

NADP/NADPH Assay Kit-WST

商品信息

储存条件：0-5度保存

运输条件：室温

特点：

● 数据可靠，不会与NAD⁺及NADH反应

● 只有Dojindo的试剂盒中带有可以简单去除蛋白质的微量管

● 享有显色底物WST专利

选择规格：

100 tests

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概述

原理

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实验例

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NO.1. FerroOrange 细胞亚铁离子检测

NO.2. Glucose Assay Kit-WST 葡萄糖检测

NO.3. Liperfluo 细胞脂质过氧化物检测

NO.4. Lactate Assay Kit-WST 乳酸检测

NO.5. Lipi-Green 脂滴检测（绿色）

试剂盒内含

NADP/NADPH Assay Kit-WST试剂盒货号：N510

概述

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP) 是磷酸戊糖途径（一种细胞代谢途径）反应中一种重要的辅因子。NADP以氧化态NADP⁺和还原态NADPH的形式存在于细胞中。NADPH不光对脂肪酸、胆固醇而且对还原型谷胱甘肽的生成至关重要。另外最近的研究表明，NADP⁺/NADPH通过限制碳水化合物的摄入来延长寿命与NADP⁺/NADPH有很大关联。

NADP/NADPH Assay Kit-WST能定量检测细胞中总NADP⁺/NADPH、NADPH和NADP⁺的量，并计算它们的比值。细胞内NADPH水平可以用试剂盒内的Extraction Buffer裂解细胞后加热进行定量检测。而细胞内的NADP⁺水平则可以通过总NADP⁺/NADPH减去NADPH的量计算得到。

原理

NADP/NADPH Assay Kit-WST试剂盒货号：N510

技术资料

分别检测NADP⁺和NADPH

NADP/NADPH Assay Kit-WST试剂盒货号：N510

分别测定NADP⁺和NADPH的操作步骤

*只有Dojindo的试剂盒中带有可以简单去除蛋白质的微量管

用试剂盒内的提取缓冲液及去除蛋白质用的微量管，能简便地制备细胞裂解液。通过加热细胞裂解液能单独检测细胞内NADPH量，而细胞内的NADP⁺量则可以通过总NADP⁺/NADPH量减去NADPH量的计算得到。

在本试剂盒中，当n=3时，可以测量12个样品和8个标准样品。使用超过12个样品时，您需要准备单独的超滤管。

使用NADP⁺/NADPH作为标记的研究

NADP/NADPH Assay Kit-WST试剂盒货号：N510

检索来源：Google Scholar

检索关键词：

NADP/NADPH：“NADP/NADPH”

线粒体：”NADP/NADPH”Mitochondria

癌：”NADP/NADPH”Cancer

氧化应激：”NADP/NADPH”Oxidative Stress

孔板检测中数据的可靠性

通过同时检测试剂盒内的标准溶液，可以对浓度在0.01-1 μmol/l的总NADP⁺/NADPH和NADPH进行定量。如果样品中的总NADP⁺/NADPH的浓度>1 μmol/l，可以通过稀释样品来调节。实验证实本试剂盒(NADP/NADPH Assay Kit-WST)不会与NAD⁺及NADH反应。

NADP/NADPH Assay Kit-WST试剂盒货号：N510

操作步骤

（1）按下图，在每孔中分别加入50 μl的标准液和样品溶液。

※为了获得准确的数据，建议每个样品做3个复孔。

NADP/NADPH Assay Kit-WST试剂盒货号：N510

（2）在每孔中加入50 μl Working Solution。

※由于在加入Working Solution后酶会立刻反应，请用多通道移液器以减少由于加液时间延迟而导致的实验误差。

（3）在37°C培养60 min。

※培养时请密封培养板，以防止液体蒸发。

（4）用酶标仪在450 nm处检测吸光度。

（5）用标准曲线测定样品中总NADP⁺/NADPH和NADPH的量。

※如果原样品在检测前已稀释，可用稀释倍率乘以检测的数值。

※NADP⁺的量可用下列计算公式计算：总NADP⁺/NADPH-NADPH的量计算得到。

NADP⁺=总NADP⁺/NADPH-NADPH

实验例

细胞样品检测实验例 (加入抗癌药物Doxorubicin)

向Jucket细胞中 (3×10⁶ cells)加入终浓度为500 nmol/l的Doxorubicin (Dox)，在培养24 h后检测NADP⁺/NADPH 比值和还原型/氧化型谷胱甘肽的比值(GSH/GSSG)。用本试剂盒检测PBS清洗后的细胞的NADP⁺/NADPH比值，用 GSSG/GSH Quantification Kit II (货号：G263) 检测谷胱甘肽的比值。

在细胞内加入DOX后，产生的ROS(H₂O₂) 破坏了DNA、DNA修复酶 (PARP*) 被激活，并且NADP⁺被其消耗。为了补充不足的NADP⁺，NADPH氧化酶被激活，结果在数据中则会表现为NADP⁺的增加。与此同时还原型谷胱甘肽 (GSH) 会被产生的ROS所消耗，因此GSH/GSSG的比值会下降。

NADP/NADPH Assay Kit-WST试剂盒货号：N510

常见问题Q&A

Q1：该试剂盒可以检测多少个样本？

A1：

NADP/NADPH Assay Kit-WST试剂盒货号：N510

*所有样品均测定3次（n=3）

上表中显示了当标准样品从2 μmol/l连续稀释，作出一条共计8个点（n=3）的标准曲线时可以检测的样品数量。如果分为2次检测，由于需要重复做一条标准曲线，因此样品检测的数量会更少。

Q2：可以单独购买过滤管吗？

A2：不可以，我们不单独出售过滤管。如果需要其他耗材，可以使用市场上售卖的过滤管。

Q3：工作液稳定吗？

A3：工作液无法长期保存。请在使用前配制工作液，由于工作液对光敏感请注意避光。该工作液在室温下可避光保存4小时。

Q4：样品颜色没有变化，是什么原因？

A4：样品中的NAD含量可能低于使用此试剂盒可测定的检测限度，在这种情况下，请增加细胞数，或者如果检测样品被稀释，则在检测前降低稀释比例。

参考文献

编号	文献	年	IF
1	Order-of-magnitude enhancement in photocurrent generation of Synechocystis sp. PCC 6803 by outer membrane deprivation	2022	17.7
2	Targeted therapy for drug-tolerant persister cells after imatinib treatment for gastrointestinal stromal tumours	2021	9.1
3	Impact of anti-diabetic sodium-glucose cotransporter 2 inhibitors on tumor growth of intractable hematological malignancy in humans	2022	7.4
4	Chemical Triggering Cyanobacterial Glycogen Accumulation: Methyl Viologen Treatment Increases Synechocystis sp. PCC 6803 Glycogen Storage by Enhancing Levels of Gene Transcript and Substrates in Glycogen Synthesis	2022	4.9
5	Glucose Limitation Sensitizes Cancer Cells to Selenite-Induced Cytotoxicity via SLC7A11-Mediated Redox Collapse, Cancers (Basel),2022, 14(2):345	2022	4.4
6	Inhibition of NAMPT markedly enhances plasma-activated medium-induced cell death in human breast cancer MDA-MB-231 cells	2019	4.1
7	Metabolomic approach to characterize the metabolic phenotypes and varied response to ouabain of diffuse large B-cell lymphoma cells	2021	2.9
8	Effect of Phosphoribosyltransferase Down-regulation on Malignant Glioma Cell Characteristics	2020	2.5

日本同仁化学NAD/NADH Assay Kit-WST试剂盒货号：N509- DOJINDO

发表于2024年6月18日由whatman中国官网

上海金畔生物科技有限公司代理日本同仁化学 DOJINDO代理商全线产品，欢迎访问官网了解更多信息

NAD/NADH Assay Kit-WST试剂盒货号：N509

NAD/NADH检测试剂盒

NAD/NADH Assay Kit-WST

商品信息

储存条件：0-5度保存

运输条件：室温

特点：

● 数据可靠，不会与NADP及NADPH反应

● 同一样品可以用Lactate Assay Kit-WST（货号：L256）测定上清液中乳酸含量

● 只有Dojindo的试剂盒中带有可以简单去除蛋白质的微量管

● 享有显色底物WST专利

选择规格：

100 tests

现货

产品解说

活动进行中

试剂盒内含

概述

原理

技术情报

操作步骤

常见问题Q&A

参考文献

产品解说

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NO.1. FerroOrange 细胞亚铁离子检测

NO.2. Glucose Assay Kit-WST 葡萄糖检测

NO.3. Liperfluo 细胞脂质过氧化物检测

NO.4. Lactate Assay Kit-WST 乳酸检测

NO.5. Lipi-Green 脂滴检测（绿色)

试剂盒内含

NAD/NADH Assay Kit-WST试剂盒货号：N509

概述

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是参与糖酵解、电子转移系统和TCA循环等细胞主要代谢途径氧化还原反应的重要辅助因子。NAD以氧化型NAD⁺和还原型NADH的形式存在于细胞中。维持适当的NAD⁺和NADH水平对细胞功能至关重要。此外最近的研究表明NAD⁺水平的下降与衰老相关，NAD⁺的量被认为是衰老相关研究的一个标志。

NAD/NADH检测试剂盒可以定量细胞中NAD⁺/NADH、NADH和NAD⁺的量，并测量它们的比值。细胞内NADH水平可以通过试剂盒内含的Extraction Buffer裂解细胞并在加热后选择性地定量检测。而细胞内的NAD⁺水平则可以通过总的NAD⁺/NADH总量减去NADH量计算得到。

原理

NAD/NADH Assay Kit-WST试剂盒货号：N509

技术情报

NAD⁺和NADH的分别检测

NAD/NADH Assay Kit-WST试剂盒货号：N509

分别测定NAD⁺和NADH的操作步骤

*只有Dojindo的试剂盒中带有可以简单去除蛋白质的微量管

用试剂盒内的提取缓冲液及去除蛋白质用的微量管，能简便地制备细胞裂解液。通过加热细胞裂解液能单独检测细胞内的NADH量。而细胞内的NAD⁺量则可以通过总NAD⁺/NADH量减去NADH量的计算得到。

在本试剂盒中，当n=3时，可以测量12个样品和8个标准品。当使用超过12个样品时，您需要准备单独的微量管。

使用NAD⁺/NADH作为指标的研究

细胞中NAD⁺和NADH的量被评估为重要的代谢指标，用于了解受药物管理和基因重组影响的癌细胞和线粒体功能。最近已经明确了长寿相关的受体与NAD⁺的含量密切相关。越来越多的人将其评估为肥胖，糖尿病和细胞分化等生物学状况的标志物。

NAD/NADH Assay Kit-WST试剂盒货号：N509

检索来源：Google Scholar

检索关键词：

NAD/NADH : “NAD/NADH”

线粒体：“NAD/NADH”Mitochondria

癌：“NAD/NADH”Cancer

肥胖：“NAD/NADH”Obesity

孔板检测中数据的可靠性

可以通过同时测量该试剂盒中包含的标准溶液来进行定量分析。如果样品中NAD⁺/NADH的总含量高于2 μmol/l，则可以通过稀释样品进行评估。在下面的实验中，使用细胞数相差2倍的HeLa细胞，来确定NAD⁺和NADH的数量和比率。

NAD/NADH Assay Kit-WST试剂盒货号：N509

使用增殖培养的HeLa细胞（2.5×10⁵，5.0×10⁵个细胞），从标准曲线中得到细胞内NAD⁺和NADH的量。最终NAD⁺的量和NADH的量会随着细胞数而改变，但是即使细胞数改变，NAD⁺和NADH量的比率也不变。

经确认，将2-Deoxy-D-glucose加入到HeLa 细胞后，代谢活性发生了变化。

用乳酸检测试剂盒检测的实验例

NAD/NADH Assay Kit-WST试剂盒货号：N509

向HeLa细胞（1×10⁶细胞）中加入2-Deoxy-D-glucose，终浓度为6 mmol/l，培养24小时后测定乳酸量和NAD⁺/NADH比。用Lactate Assay Kit-WST（货号：L256）测定上清液中乳酸含量，去除上清后用本试剂盒检测细胞中的NAD⁺/NADH比。

最终加入2-Deoxy-D-glucose抑制了细胞内糖酵解系统，并导致乳酸量的减少和NAD⁺/NADH比率的增加。

实验例：NASH诱导小鼠肝脏组织中代谢的变化

非酒精性脂肪肝炎（NASH）病变导致组织中ATP、α-酮戊二酸（α-KG），已知NAD量减少。使用从4周龄开始进行高脂肪饮食处理（NASH诱导）的1型糖尿病模型小鼠（STAM模型）的肝脏组织α-测量了KG、NAD量。其结果，在NASH诱导后10周龄小鼠组织

非酒精性脂肪肝炎（NASH）病变导致组织中ATP、α-酮戊二酸（α-KG），已知NAD量减少。使用从4周龄开始进行高脂肪饮食处理（NASH诱导）的1型糖尿病模型小鼠（STAM模型）的肝脏组织α-测量了KG、NAD量。其结果，在NASH诱导后10

中α-确认KG、NAD量减少。

NAD/NADH Assay Kit-WST试剂盒货号：N509

<使用产品>

・组织内ATP:ATP Assay Kit-Luminescence（产品货号：A550）

・组织内α-KG：α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric（产品货号：K261）

・组织内NAD:NAD/NADH Assay Kit-WST（产品货号：N509）

<実験参考文献>

ATP　 Francesco Bellanti, et al., “Synergistic interaction of fatty acids and oxysterols impairs mitochondrial function and limits liver adaptation during nafld progression”, Redox Biology, 2018, 15, 86-96..

α-KG Jianjian Zhao, et al., “The mechanism and role of intracellular α-ketoglutarate reduction in hepatic stellate cell activation”, Bioscience Reports, 2020, 40, (3).

Ali Canbay, et al., “L‑Ornithine L‑Aspartate (LOLA) as a Novel Approach for Therapy of Non‑alcoholic Fatty Liver Disease”, Drugs, 2019, 79, 39-44.

NAD Jinhan He, et al., “Activation of the Aryl Hydrocarbon Receptor Sensitizes Mice to Nonalcoholic Steatohepatitis by Deactivating Mitochondrial Sirtuin Deacetylase Sirt3”, Mol. and Cell. Biol., 2013, 33, (10), 2047-55.

实验例：脂肪酸转运抑制剂引起的HeLa细胞细胞内代谢的変化

脂肪酸对膜的合成等重要，细胞的增殖不可缺少。因此，用脂肪酸转运体抑制剂处理HeLa细胞，确认了阻碍脂肪酸摄取时的细胞增殖能力及细胞内代谢（葡萄糖消耗量、Lactate释放量、NAD/NADH比率）的变化。

结果显示，细胞增殖能力下降，但葡萄糖消耗量和Lactate释放量增加，细胞内NAD+/NDH比率下降，因此确认了代谢途径向解糖类转移。

NAD/NADH Assay Kit-WST试剂盒货号：N509

＜使用产品＞

脂肪酸摄取：Fatty Acid Uptake Assay Kit (产品货号：UP07)

细胞增殖： Cell Counting Kit-8 (产品货号：CK04)

Glucose摄取：Glucose Assay Kit-WST (产品货号：G264)

Lactate检测：Lactate Assay Kit-WST (产品货号：L256)

实验例：诱导老化引起的A549细胞的代谢移位

当细胞老化被诱导时，SA-β-除了出现gal的表达亢进和不可逆的细胞增殖停止的现象以外，DNA损伤积蓄了的老化细胞，由于线粒体功能的降低能源产生转移到解糖系。

因此，用Doxorubicin处理A549细胞，诱导老化时的SA-β-确认了gal表达亢进及能量产生途径（NAD量、线粒体膜电位、ATP量、Lactate释放量）的偏移。

结果发现DNA损伤，SA-β-刚度测量-β- Galactosidase）生产量增加，细胞内NAD+量下降，线粒体膜电位下降，能量生产途径从氧化性磷酸化转移到解糖系

NAD/NADH Assay Kit-WST试剂盒货号：N509

＜使用产品＞

DNA损伤：DNA Damage Detection Kit – γH2AX (产品货号：G265)

SA-β-gal检测：Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal (产品货号：SG03)

NAD+量：NAD/NADH Assay Kit-WST (产品货号：N509)

线粒体膜电位：JC-1 MitoMP Detection Kit (产品货号：MT09)

糖酵解/氧化磷酸化：Glycolysis/OXPHOS Assay Kit (产品货号：G270)

操作步骤

NAD/NADH Assay Kit-WST试剂盒货号：N509

(1) 按照上图，在每孔中分别加入50 μl的标准液和样品溶液。

※为了获得准确的数据，建议每个样品做3个复孔。

(2) 在每孔中加入50 μl Working Solution。

※由于在加入Working Solution后酶会立刻反应，请用多通道移液器以减少由于加液时间延迟而导致的实验误差。

(3) 在37℃培养60 min。

※培养时请密封培养板，以防止液体蒸发。

(4) 用酶标仪在450 nm处检测吸光度。

(5) 用标准曲线测定样品中总NAD⁺/NADH和NADH的量。

※如果原样品在检测前已稀释，可用稀释倍率乘以检测的数值。

※NAD⁺的量可用总NAD⁺/NADH的量-NADH的量计算得到

NAD⁺= 总NAD⁺/NADH-NADH

NAD/NADH Assay Kit-WST试剂盒货号：N509

常见问题Q&A

Q1：试剂盒可以测量多少个样本？

A1：

NAD/NADH Assay Kit-WST试剂盒货号：N509

*所有样品均测定3次（n=3）

Q2：是否可以使用450 nm以外的滤光片进行测量？

A2：也可以使用490 nm的滤光片，但是吸光度会低于在450 nm处的吸光度。当用不同滤光片检测时，校准曲线如下：

NAD/NADH Assay Kit-WST试剂盒货号：N509

Q3：可以单独购买过滤管吗？

A3：不可以，我们不单独出售过滤管。如果需要其他耗材，可以使用市场上售卖的过滤管。

Q4：工作液稳定吗？

A4：工作液无法长期保存。请在使用前配制工作液，由于工作液对光敏感请注意避光。该工作液在室温下可避光保存4小时。

Q5：样品颜色没有变化，是什么原因？

A5：样品中的NAD含量可能低于使用此试剂盒可测定的检测限度，在这种情况下，请增加细胞数，或者如果检测样品被稀释，则在检测前降低稀释比例。

Q6：有使用组织的实验例子吗？

A6：我们已经用小鼠肝组织测量了NAD/NADH和ATP,有关实验操作的更多信息，请参见下文。

碱性提取法提取肝脏代谢指标

1.每100毫克小鼠肝脏500毫升500摩尔/升KOH的冷水。

请务必将纸巾彻底沥干。残余血液会影响测量。

2.它被向下型均化器粉碎。

*请去冰浴。

3.用500ml冷的0.5mol/l KOH水溶液共同洗涤用于破碎的容器，以匹配管中的样品。（共1毫升）

4.向样品管中加入1毫升冷的超纯水。（共2毫升）如果溶液的粘度高，操作后可能难以分离离心机。

在这种情况下，将25g（针的针数）的细针应用于注射器，并混合（20-30次），直到样品溶液顺利放入注射器。

5.在5000 x g，4°C下离心5分钟，上清液回收到两个900 mm L的样品管中。1个NAD/NADH测量和另一个用于ATP测量。NAD/NA

NAD/NADH测量样品的制备

将0.5mol/L KOH水溶液和1mol/L KH₂PO₄混合制备稀释溶液。KH₂PO₄水溶液，比例为9:5。

6.将样品转移到MWCO 10K膜沉积管中，并在15000xg下离心20分钟。

*如果溶液超过200克或更多，请延长离心时间。

7.将所得滤液加入1.5 ml微管μ中，转移总NAD+/NADH含量和NADH量样品。

8.NADH量测量样品在60°C下孵育60分钟，将样品冷却至室温。

9.中和完成后，加入1mol/L的KH₂PO₄。22μL放入装有总NAD+/NADH量和制备后NADH量测量样品的管中，

中和溶液，加入78ml稀溶液（KOH和KH₂PO₄），混合混合物，将样品用作测量样品（总计200ul）。

＜测定例＞

NASH诱导小鼠肝脏组织中NAD量的变化

NAD/NADH Assay Kit-WST试剂盒货号：N509

Q7:测量样品可以保存吗？

A7.可以保存。使用说明书(1.测定用样品的调制的操作6）的溶液，在冷冻（-20℃）下可以保存3周。

参考文献

编号	文献	年	IF
1	Restoring NAD+ by NAMPT is essential for the SIRT1/p53-mediated survival of UVA- and UVB-irradiated epidermal keratinocytes	2021	6.8
2	Rewired Cellular Metabolic Profiles in Response to Metformin under Different Oxygen and Nutrient Conditions, International Journal of Molecular Sciences，2022, 23(2):989	2022	5.9
3	SIRT3-Mediated SOD2 and PGC-1α Contribute to Chemoresistance in Colorectal Cancer Cells, Annals of Surgical Oncology,2021, 28(8):4720-4732	2021	5.3
4	Nicotinamide Attenuates the Progression of Renal Failure in a Mouse Model of Adenine-Induced Chronic Kidney Disease	2021	5.1
5	Impact of Nuclear De Novo NAD+ Synthesis via Histone Dynamics on DNA Repair during Cellular Senescence To Prevent Tumorigenesis	2022	5.1
6	Role of pyruvate in maintaining cell viability and energy production under high-glucose conditions	2021	4.9
7	Kynurenine, 3-OH-kynurenine, and anthranilate are nutrient metabolites that alter H3K4 trimethylation and H2AS40 O-GlcNAcylation at hypothalamus-related loci	2019	4.9
8	Porcine placental extract increase the cellular NAD levels in human epidermal keratinocytes	2022	4.9
9	Nicaraven induces programmed cell death by distinct mechanisms according to the expression levels of Bcl-2 and poly (ADP-ribose) glycohydrolase in cancer cells	2022	4.8
10	Effects of sirtuins on the riboflavin production in Ashbya gossypii	2021	4.8
11	SIRT7 regulates the nuclear export of NF-κB p65 by deacetylating Ran, Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research,2019, 1866(9):1355-1367	2019	4.7
12	Epigenetic silencing of Lgr5 induces senescence of intestinal epithelial organoids during the process of aging,NPJ Aging and Mechanisms of Disease,2018, 5:1	2018	4.3
13	Effect of fumaric acid on the growth of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus during yogurt fermentation	2021	4.2
14	SIRT3-Mediated SOD2 and PGC-1α Contribute to Chemoresistance in Colorectal Cancer Cells, Annals of Surgical Oncology,2021, 28(8):4720-4732	2021	4.1
15	High expression of NAMPT in adult T-cell leukemia/lymphoma and anti-tumor activity of a NAMPT inhibitor, The European Journal of Pharmacology，2019, 865:172738	2019	3.0
16	Lactic acid induces HSPA1A expression through ERK1/2 activation	2022	2.4
17	Contribution of GPD2/mGPDH to an alternative respiratory chain of the mitochondrial energy metabolism and the stemness in CD133-positive HuH-7 cells, Genes to Cells,2020, 25(2):139-148	2020	1.9

日本同仁化学Glutamate Assay Kit-WST试剂盒货号：G269- DOJINDO

发表于2024年6月18日由whatman中国官网

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Glutamate Assay Kit-WST试剂盒货号：G269

谷氨酸的定量检测试剂盒

Glutamate Assay Kit-WST

商品信息

储存条件：0-5度保存

运输条件：室温

特点：

● 享有显色底物WST专利

● 用于L-Glutamate的定量

选择规格：

1set

现货

活动进行中

试剂盒内含

产品概述

原理

操作步骤

实验例

常见问题Q&A

参考文献

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凑单关联产品TOP5

NO.1. FerroOrange 细胞亚铁离子检测

NO.2. Glutamine Assay Kit-WST 谷氨酰胺的定量检测

NO.3. GSSG/GSH Quantification Kit II 氧化型/还原型谷胱甘肽定量

NO.4. Liperfluo 细胞脂质过氧化物检测

NO.5. Mito-FerroGreen 铁离子荧光探针

试剂盒内含

Glutamate Assay Kit-WST试剂盒货号：G269

产品概述

谷氨酸不仅用于蛋白质和谷胱甘肽的生物合成，而且还作为神经递质发挥重要作用，谷氨酸过多被认为是引起神经退行性疾病如阿尔茨海默氏病的原因。根据文献报道，胱氨酸/谷氨酸的转运蛋白(xCT)具有吸收胱氨酸放出谷氨酸的功能，而抑制xCT会诱导细胞发生铁依赖性的死亡—铁死亡，近年来针对xCT的癌症研究越来越多。

Glutamate Assay Kit-WST是谷氨酸的定量检测试剂盒。细胞培养基中或细胞内的谷氨酸都可以通过WST的还原反应进行定量，谷氨酸定量的最低浓度为5 μmol/l。此外，本试剂盒还可以使用96孔板进行多样品批量检测。

原理

本试剂盒通过WST的还原反应对细胞和培养基中的谷氨酸进行定量。此外，本试剂盒还包含谷氨酸标准溶液，可用于通过制作标准曲线来定量样品中谷氨酸的浓度。

操作步骤

只需将细胞培养上清液或组织/细胞裂解溶液转移到孔板中，加入试剂后孵育即可。

Glutamate Assay Kit-WST试剂盒货号：G269

实验例

标准曲线的实验例：

样品中的谷氨酸浓度可通过使用该试剂盒的谷氨酸标准溶液制作标准曲线来确定。如果谷氨酸浓度为0.5 mmol/l或更高，则可以通过稀释样品进行检测。

Glutamate Assay Kit-WST试剂盒货号：G269

谷氨酰胺和谷氨酸的检测实验例：

将A549细胞接种在6孔板中，用Glutamine Assay Kit-WST和Glutamate Assay Kit-WST分别检测细胞培养上清液中谷氨酰胺和谷氨酸浓度随培养时间的变化。

结果，培养基中的谷氨酰胺浓度随培养时间增加而降低，而谷氨酸浓度则升高。

Glutamate Assay Kit-WST试剂盒货号：G269

铁死亡研究中谷氨酸和谷胱甘肽的检测实验例:

据报道通过弹性蛋白，抑制胱氨酸/谷氨酸转运体(xCT)造成铁依赖性的细胞死亡，即细胞铁死亡。在通过弹性蛋白处理后的A549细胞中，确认谷氨酸的释放量和细胞内谷胱甘肽的量。结果显示，通过弹性蛋白处理的细胞中谷氨酸释放的量减少，抑制胱氨酸的摄取，从而导致谷胱甘肽的量减少。

Glutamate Assay Kit-WST试剂盒货号：G269

Sulfasalazine (SSZ) 引起的细胞内代谢变化实验例：

将已知会抑制胱氨酸/谷氨酸转运体(xCT)的Sulfasalazine(SSZ)加入到A549细胞后，确认谷氨酸释放量、细胞内ATP、α-酮戊二酸(α-KG)、谷胱甘肽(GSH)以及ROS的变化。

结果显示，SSZ加入后细胞内ATP、谷胱甘肽(GSH)和谷氨酸释放量减少，细胞内α-酮戊二酸和ROS增加。 Glutamate Assay Kit-WST试剂盒货号：G269

<使用产品>

· 细胞内GSH：GSSG/GSH Quantification Kit II（货号：G263）⬅电脑浏览点击品名（手机浏览点击此处）

· 细胞内ROS：ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-（货号：R252）⬅电脑浏览点击品名（手机浏览点击此处）

· 细胞内ATP：ATP Assay Kit-Luminescence（货号：A550）

· 细胞内α-KG：α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric（货号：K261）

<实验条件>

细胞：A549细胞 (1 x 10⁶ cells) 　药物处理时间：48 h

Glutamate Assay Kit-WST试剂盒货号：G269

参考文献) Shogo Okazaki et al.,”Glutaminolysis-related genes determine sensitivity to xCT-targeted therapy in head and neck squamous cell carcinoma”.Cancer Sci.,2019,doi:10.1111/cas.14182.

常见问题Q&A

Q1：一个试剂盒可以检测样品的数量是多少？

A1：制备标准曲线和样品(n=3)，可以检测的样品数量如下所示。

100 tests

样品数量(n=3) 24个样品(参照下图)

谷氨酸标准溶液和样品的96孔板排列示意图(n=3)

Glutamate Assay Kit-WST试剂盒货号：G269

Q2：配制后的Working solution可以保存多久？

A2：Working solution无法保存，需要现配现用。此外光会影响Working solution的稳定性，所以配制后请避光。

※Working solution配制后，避光室温条件下4 h稳定。当暴露于光线下，溶液的颜色会变成褐色。

Q3：是否可以定量D-Glutamate？

A3：该试剂盒是用于L-Glutamate定量，无法定量D-Glutamate。

Q4：是否可以检测含有还原性物质的样品？

A4：如果样品中含有还原性的物质，则WST染料也会发生显色，此时无法准确定量谷氨酸浓度。实验中如遇到以上情况，可以准备药物对照(不含细胞含药物的培养基+试剂)。

Q5：待测样品可以保存吗？

A5：我们确认过细胞培养上清液样品可以-20°C保存1个月。

细胞裂解样品也可以-20°C保存1个月。但是，在保存之前请使用试剂盒中的Filtration Tube进行脱蛋白处理。

Q6：为什么我的样品孔没有显色？

A6：样品中的谷氨酸浓度可能低于检测限(5 µmol/l)，谷氨酸浓度低于5 µmol/l的样品无法用该试剂盒检测。

如果待测样品被稀释，则稀释样品中含有的谷氨酸浓度可能低于5 µmol/l。请减少稀释比例，从而将检测样品的谷氨酸浓度调整到最低检测限以上。

Q7：是否可以使用450 nm以外波长的滤光片进行检测？

A7：也可以使用490 nm的滤光片。但是，吸光度会低于在450nm处的吸光度。(见下图)

Glutamate Assay Kit-WST试剂盒货号：G269

参考文献

1)Cobler,L.et al.,”xCT inhibition sensitizes tumors to γ-radiation via glutathione reduction”,Oncotarget,2018,9,32280-32297.

2)Tobias,M.et al.,”Role of GPX4 in ferroptosis and its pharmacological implication”,Free Radical Bioglogy and Medicine,2019,133,144-152.

3)K. Danchana, H. Iwasaki, K. Ochiai, H. Namba, T. Kaneta, “Determination of glutamate using paper-based microfluidic devices with colorimetric detection for food samples”, Microchem. J., 2022, doi:10.1016/j.microc.2022.107513.

4)Z. Xie, T. Kawasaki, H. Zhou, D. Okuzaki, N. Okada and M. Tachbana, “Targeting GGT1 Eliminates the Tumor-Promoting Effect and Enhanced Immunosuppressive Function of Myeloid-Derived Suppressor Cells Caused by G-CSF”, Front. Pharmacol., 2022, doi:10.3389/fphar.2022.873792.

日本同仁化学Glutamine Assay Kit-WST试剂盒货号：G268- DOJINDO

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Glutamine Assay Kit-WST试剂盒货号：G268

谷氨酰胺定量检测试剂盒

Glutamine Assay Kit-WST

商品信息

储存条件：0-5度保存，避光防潮

运输条件：室温

特点：

● 享有显色底物WST专利

● 用于L-Glutamine的定量

选择规格：

1set

现货

产品解说

活动进行中

试剂盒内含

产品概述

原理

操作步骤

实验例

常见问题Q&A

参考文献

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NO.2. GSSG/GSH Quantification Kit II 氧化型/还原型谷胱甘肽定量

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NO.4. Liperfluo 细胞脂质过氧化物检测

NO.5. Mito-FerroGreen 铁离子荧光探针

试剂盒内含

Glutamine Assay Kit-WST试剂盒货号：G268

产品概述

谷氨酰胺是TCA循环的中间体α-酮戊二酸的主要来源，并且是用于核酸和其他氨基酸合成及能量产生的重要物质。根据文献报道特别是在癌细胞中，谷氨酰胺作为底物可促进Glutaminolysis的生成，而Glutaminolysis是产生α-酮戊二酸的途径之一。同时Glutaminolysis还可以消除活性氧并减少氧化型谷胱甘肽。

Glutamine Assay Kit-WST是用于定量检测谷氨酰胺的试剂盒。无论是培养基内还是细胞内的谷氨酰胺均可以通过WST的还原反应进行定量，可检测的最低浓度为5 μmol/l。此外，本试剂盒还可使用96孔板进行多样品批量检测。

原理

本试剂盒通过WST的还原反应对细胞和培养基中的谷氨酰胺进行定量。此外，本试剂盒还包含谷氨酰胺标准溶液，可用于通过制作标准曲线来定量样品中谷氨酰胺的浓度。

Glutamine Assay Kit-WST试剂盒货号：G268

操作步骤

*向谷氨酰胺标准溶液和含有谷氨酰胺酶的样品孔中加入谷氨酰胺酶溶液，并在样品(不含谷氨酰胺酶溶液)的每个孔中加Reaction Buffer。

由下式算出检测样品中的谷氨酰胺浓度。

样品中的谷氨酰胺浓度(mmol/l)＝(含有谷氨酰胺酶溶液)-(不含谷氨酰胺酶溶液)

Glutamine Assay Kit-WST试剂盒货号：G268

实验例

标准曲线的实验例：

样品中的谷氨酰胺浓度可通过使用该试剂盒的谷氨酰胺标准溶液制作标准曲线来确定。如果谷氨酰胺浓度为0.5 mmol/l或更高，则可以通过稀释样品进行检测。

Glutamine Assay Kit-WST试剂盒货号：G268

谷氨酰胺和谷氨酸的检测实验例：

将A549细胞接种在6孔板中，用Glutamine Assay Kit-WST和Glutamate Assay Kit-WST分别检测细胞培养上清液中谷氨酰胺和谷氨酸浓度随培养时间的变化。

结果，培养基中的谷氨酰胺浓度随培养时间增加而降低，而谷氨酸浓度则升高。

Glutamine Assay Kit-WST试剂盒货号：G268

常见问题Q&A

Q1：一个试剂盒可以检测样品的数量。

A1：制备标准曲线和样品(n=3)，可以检测的样品数量如下所示。

100 tests

样品数量(n=3) 12个样品(参照下图)

谷氨酰胺标准溶液和样品的96孔板排列示意图(n=3)

Glutamine Assay Kit-WST试剂盒货号：G268

＊当n=3时，至少需要240 μl(每孔40 μl×6孔)。

样品中的谷氨酰胺浓度(mmol/l)＝(含有谷氨酰胺酶溶液)-(不含谷氨酰胺酶溶液)

Q2：配制后的Working solution可以保存多久？

A2：Working solution无法保存，需要现配现用。此外光会影响Working solution的稳定性，所以配制后请避光。

Q3：是否可以定量D-Glutamine？

A3：该试剂盒是用于L-Glutamine定量，无法定量D-Glutamine。

Q4：是否可以检测含有还原性物质的样品？

A4：如果样品中含有还原性的物质，则WST染料也会发生显色，此时无法准确定量谷氨酰胺浓度。实验中如遇到以上情况，可以准备药物对照(不含细胞含药物的培养基+试剂)。

Q5：待测样品可以保存吗？

A5：我们确认过细胞培养上清液样品可以-20°C保存1个月。

细胞裂解液样品也可以-20°C保存1个月。但是，在保存之前请使用试剂盒中的Filtration Tube进行脱蛋白处理。

Q6：为什么我的样品孔没有显色？

A6：样品中的谷氨酰胺浓度可能低于检测限(5 µmol/l)，谷氨酰胺浓度低于5 µmol/l的样品无法用该试剂盒检测。如果待测样品被稀释，则稀释样品中含有的谷氨酰胺浓度可能低于5 µmol/l。请减少稀释比例，从而将检测样品的谷氨酰胺浓度调整到最低检测限以上。

Q7：是否可以使用450 nm以外波长的滤光片进行检测？

A7：也可以使用490 nm的滤光片。但是，吸光度会低于在450nm处的吸光度。(见下图)

Glutamine Assay Kit-WST试剂盒货号：G268

参考文献

1、K. Hayashima, H. Katoh, “Expression of gamma-glutamyltransferase 1 in glioblastoma cells confers resistance to cystine deprivation-induced ferroptosis”, J. Biol. Chem., 2022, doi:10.1016/j.jbc.2022.101703.

2、R. Imamura, S. Kitagawa, T. Kubo, A. Irie, T. Kariu, M. Yoneda, T. Kamba, T. Imamura, “Prostate cancer C5a receptor expression and augmentation of cancer cell proliferation, invasion, and PD‐L1 expression by C5a”, Prostate, 2020, doi:10.1002/pros.24090.

3、S. Liu, J. Washio, S. Sato, Y. Abiko, Y. Shinohara, Y. Kobayashi, H. Otani, S. Sasaki, X. Wang and N. Takahashi, “Rewired Cellular Metabolic Profiles in Response to Metformin under Different Oxygen and Nutrient Conditions”, 2022, Int. J. Mol. Sci., doi:10.1016/j.snb.2021.130554.

4、M Chen, G Wang, Z Xu, J Sun, B Liu, L Chang, J Gu, Y Ruan, X Gao,S Song,Loss of RACK1 promotes glutamine addiction via activating AKT/mTOR/ASCT2 axis to facilitate tumor growth in gastric cancer,Cellular Oncology, 2023,doi:https://doi.org/10.1007/s13402-023-00854-1.

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日本同仁化学Cell Counting Kit-Luminescence试剂盒货号：CK18- DOJINDO

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Cell Counting Kit-Luminescence试剂盒货号：CK18

细胞活性（ATP检测）

ATP Assay Kit-Luminescence

商品信息

储存条件：0-5度保存

运输条件：室温

特点：

● 操作简便，检测仅需10分钟

● 灵敏度高，微量细胞也可检测

● 悬浮细胞和原代细胞适合

选择规格：

200 tests

600 tests

1000 tests

2000 tests

现货

Cell Counting Kit-Luminescence试剂盒货号：CK18

产品解说

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产品原理

实验注意事项

实验操作步骤

参考文献

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产品原理

Cell Counting Kit-Luminescence试剂盒货号：CK18

图1. Cell Counting Kit Luminescence 检测原理

实验注意事项

检测方法：多功能酶标仪

检测结果：化学发光值

Cell Counting Kit-Luminescence试剂盒货号：CK18

注意：该试剂盒只能比较实验组对照组结果，但是不能完全定量检测

（试剂盒内不含标准品）

实验操作步骤

1. 白色 96 孔板中，每孔加入 100 μl 细胞悬液（白色 384 孔板，每孔加入 25 μl 细胞悬液）。

*为了获得更准确的检测结果，建议每个实验组至少设置三个复孔（n=3）。

2. 各孔中加入 100 μl Working solution（白色 384 孔板，每孔加入 25 μl Working solution）。

*气泡会对实验结果产生影响，如果孔中有气泡请尽量清除。使用电动移液器时，建议使用反向吸液模式(RevPIP Mode)。

*加入 Working solution 后，建议用酶标仪的振荡混匀功能震荡 2 min。由于光照会影响检测结果，如果必须在有光源的地方震荡，建议用铝箔纸包覆孔板。

3. 将孔板静置于温度设定在 25℃的酶标仪内 10 min。

*如果酶标仪没有温度设定的功能，请将孔板至于 25℃培养箱或 25℃左右室温下，避光培养 10 min。

*为了保证发光信号的稳定性，建议此处的培养时间不要低于 10 min。

4. 检测发光值（RLU）。

CCK-L，仪器检测实验例，详见如下：（实验例仅供参考）

细胞内ATP活性检测（CCK-L）的仪器设置

参考文献

编号	文献	年	IF
1	Impact of the combined timing of PD-1/PD-L1 inhibitors and chemotherapy on the outcomes in patients with refractory lung cancer, ESMO Open,2021, 6(2):100094	2021	6.5
2	SIRT3-Mediated SOD2 and PGC-1α Contribute to Chemoresistance in Colorectal Cancer Cells ,Annals of Surgical Oncology,2021, 28(8):4720-4732	2021	5.3
3	An Fc-muted bispecific antibody targeting PD-L1 and 4-1BB induces antitumor immune activity in colorectal cancer without systemic toxicity，Cellular & Molecular Biology Letters， 2023，doi.org/10.1186/s11658-023-00461-w	2023	8.3

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日本同仁化学线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01- DOJINDO

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线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01

线粒体自噬检测试剂盒

Mitophagy Detection Kit

商品信息

特点：

● 只需添加小分子量荧光试剂即可轻松检测线粒体

● 可以使用荧光显微镜进行活细胞成像

● 可以与附着的溶酶体染色剂同时染色

下载说明书

产品文献

SDS下载

选择规格：

1set

现货

线粒体自噬检测

活动进行中

试剂盒内含

产品概述

原理

实验例

荧光特性

参考文献

常见问题Q&A

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线粒体自噬大揭秘丨从实验思路到检测指标 PDF下载

关联指标干货参考（点击查看）		检测指标（点击查看）
线粒体自噬详述		Mitophagy Detection Kit（本产品）
多细胞器共染&线粒体动力学		MitoBright IM Red for Immunostaining
多细胞器共染&线粒体动力学		MitoBright LT Green/Red/Deep Red
线粒体功能		JC-1 、MT-1
		CCK-L、ADP/ATP比率检测
		Oxygen Consumption Rate(OCR)
		mtSOX
		ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-
		ROS Assay Kit -Photo-oxidation Resistant DCFH-DA-
Ca2+从内质网到线粒体		Fura 2-AM
		Fluo 4-AM
		Rhod 2-AM
线粒体自噬-溶酶体功能		Lysosomal Acidic pH Detection Kit
线粒体自噬-溶酶体功能		Lysosomal Acidic pH Detection Kit-Green/Deep Red
线粒体自噬-脂质定位&定量		Lipi-Blue/Green/Red/Deep Red
线粒体自噬-脂质定位&定量		Lipid Droplet Assay Kit-Blue/Deep Red
细胞死亡		Cell Counting Kit-8
		Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST
		Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit

*点击即可跳转至详情页

试剂盒内含

线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01

产品概述

线粒体 (Mitochondria) 是细胞中重要的细胞器之一，可以为细胞活力提供能量。近年有报道去极化线粒体的积累引起的阿尔茨海默病 (Alzheimer’s Disease) 与帕金森病(Parkinson’s Disease)，可能与线粒体自噬有关。线粒体自噬是一种清除机制，可以通过自噬，将氧化应激、DNA损伤因素导致功能失调的线粒体隔离包裹成自噬体(Autophagosome)，再与溶酶体 (Lysosome) 融合后降解。本试剂盒内含Mtphagy Dye (用于检测线粒体自噬) 和Lyso Dye (溶酶体染料)。Mtphagy Dye通过化学结合，固定在细胞内的线粒体上，会发出较弱的荧光。当线粒体发生自噬，损伤的线粒体会与溶酶体融合，pH会下降，变成酸性，此时Mtphagy Dye会产生较强的荧光。如想直观观察Mtphagy Dye标记的线粒体和溶酶体的结合，可联合应用试剂盒中的Lyso Dye (标记溶酶体) 进行双染。

特点：

1）只需添加小分子量荧光试剂即可轻松检测线粒体

2）可以使用荧光显微镜进行活细胞成像

3）可以与附着的溶酶体染色剂同时染色

原理

记载了本产品的检测原理和实验例的论文请看MD01论文实验例中第四篇：Live Cell Imaging of Mitochondrial Autophagy with a Novel Fluorescent Small Molecule

线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01

实验例

1.用羰基氰化物间氯苯腙 (CCCP，一种线粒体解偶联剂) 诱导Parkin表达的HeLa细胞线粒体自噬，并通过荧光显微镜进行检测。另外，通过与线粒体染色试剂（MitoBright Deep Red:MT08）一同染色，能够区分出已发生自噬的的线粒体（白色）和未发生自噬的线粒体（紫色）（照片：右侧）。

线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01

波长：

Mtphagy Dye:561 nm (Ex)、650 LP nm (Em)

Lyso Dye:488 nm (Ex)、502-554 nm (Em)

MitoBright Deep Red:640 nm (Ex)、656-700 nm (Em)

2.荧光显微镜观察

HeLa细胞用CCCP处理，并与线粒体检测试剂（Mtphagy Dye）和线粒体染色试剂（MitoBright LT Green）共同染色，并经过一段时间（6小时）后进行检测。

<检测条件>

设备：LSM-700 Laser scanning confocal microscope (LSCM)

(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)

激发波长：

MitoBright LT Green 488 nm

Mtphagy Dye 555 nm

物镜：63x

拍摄时间：6小时

拍摄间隔：15秒

3.自噬诱导和线粒体膜电位变化关系的检测

用羰基氰化物间氯苯腙(CCCP，一种线粒体解偶联剂)诱导Parkin表达的HeLa细胞线粒体自噬，并使用线粒体自噬检测试剂盒（Mitophagy Detection Kit：MD01）和线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1 MitoMP Detection Kit：MT09）观察荧光结果。

结果证实在未经CCCP处理的细胞中几乎未检测到线粒体自噬的发生，并且线粒体膜电位正常维持。另一方面，在添加了CCCP的细胞中，证实了线粒体膜电位的降低（JC-1的红色荧光降低）和线粒体自噬的发生（Mtphagy染料的荧光增强）。

<实验条件>

■将Parkin质粒导入HeLa细胞

使用HilyMax（货号：H357）将Parkin质粒引入HeLa细胞中（Parkin质粒/HilyMax试剂：0.1 μg/0.2 μl）

过夜培养后进行检测。

■线粒体自噬检测

向表达Parkin的HeLa细胞中添加0.1 μmol/l Mtphagy工作溶液，并在37°C下孵育30分钟。然后将细胞用HBSS洗涤，加入10 μg/ml CCCP/MEM溶液，并在37℃下孵育2小时。在荧光显微镜下观察细胞。

■线粒体膜电位检测

将10 μg/ml的CCCP/MEM溶液添加至表达Parkin的HeLa细胞中，并在37℃下孵育1.5小时。加入4 μmol/l的JC-1工作液使其终浓度达到2 μmol/l，并在37℃下孵育30分钟。孵育后，将细胞用HBSS洗涤，加入成像缓冲液，并在荧光显微镜下观察细胞。

线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01

<检测条件>

■线粒体自噬检测

Ex：561 nm，Em：570-700 nm

■线粒体膜电位检测

绿色Ex：488 nm，Em：500-550 nm

红色Ex：561 nm，Em：560-610 nm

荧光特性

线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01

参考文献

序号	检测对象	使用仪器	文献
1)	细胞（HeLa）	流式细胞仪	J. Koniga, C. Otta, M. Hugoa, T. Junga, A. L. Bulteaub, T. Grunea and A. Hohna, “Mitochondrial contribution to lipofuscin formation”, Redox Biology, 2017, 11, 673.
2)	细胞（KB）	荧光显微镜	K. Kameyama, “Induction of mitophagy-mediated antitumor activity with folate-appended methyl-β-cyclodextrin”, International Journal of Nanomedicine, 2017, 12, 3433.
3)	细胞（SH-SY5Y, 初代皮质神经细胞）	荧光显微镜	E. F. Fang, T. B. Waltz, H. Kassahun, Q. Lu, J. S. Kerr, M. Morevati, E. M. Fivenson, B. N. Wollman, K. Marosi, M. A. Wilson, W. B. Iser, D. M. Eckley, Y. Zhang, E. Lehrmann, I. G. Goldberg, M. S. Knudsen, M. P. Mattson, H. Nilsen, V. A. Bohr and K. G. Becker, “Tomatidine enhances lifespan and healthspan in C. elegans through mitophagy induction via the SKN-1/Nrf2 pathway”, Scientific Reports, 2017, 7, (46208), DOI: 10.1038/srep46208.
4)	细胞（HeLa、Parkin表达HeLa）	荧光显微镜	H. Iwashita, S. Torii, N. Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K. Sasamoto, S. Shimizu and K. Okuma, “Live Cell Imaging of Mitochondrial Autophagy with a Novel Fluorescent Small Molecule”, ACS Chem. Biol., 2017, 12, (10), 2546.
5)	细胞（Cardiomyocytes）	流式细胞仪	Y. Feng, NB. Madungwe, CV. da Cruz Junho and JC. Bopassa, “Activation of G protein-coupled oestrogen receptor 1 at the onset of reperfusion protects the myocardium against ischemia/reperfusion injury by reducing mitochondrial dysfunction and mitophagy.”, Br. J. Pharmacol., 2017, 174, (23), 4329.
6)	细胞（HCT116）	荧光显微镜	K. M. Elamin, K. Motoyama, T. Higashi, Y. Yamashita, A. Tokuda and H. Arima, “Dual targeting system by supramolecular complex of folate-conjugated methyl-β-cyclodextrin with adamantane-grafted hyaluronic acid for the treatment of colorectal cancer.”, Int. J. Biol. Macromol., 2018, doi: 10.1016/j.ijbiomac.2018.02.149.
7)	细胞（Parkin-HeLa）	流式细胞仪	N. Furuya, S. Kakuta, K. Sumiyoshi, M. Ando, R. Nonaka, A. Suzuki, S. Kazuno, S. Saiki and N. Hattori, “NDP52 interacts with mitochondrial RNA poly(A) polymerase to promote mitophagy.”, EMBO Rep. ., 2018, doi: 10.15252/embr.201846363.
8)	细胞（NKT）	流式细胞仪	L. Zhu, X. Xie, L. Zhang, H. Wang, Z. Jie, X. Zhou, J. Shi, S. Zhao, B. Zhang, X. Cheng and S. Sun, “TBK-binding protein 1 regulates IL-15-induced autophagy and NKT cell survival”, Nature Communications., 2018, 9, (1), doi:10.1038/s41467-018-05097-5.
9)	细胞（HeLa）	流式细胞仪	K. Araki, K. Kawauchi, W. Sugimoto, D. Tsuda, H. Oda, R. Yoshida and K. Ohtani, “Mitochondrial protein E2F3d, a distinctive E2F3 product, mediates hypoxia-induced mitophagy in cancer cells”, Commun Biol., 2019, DOI: 10.1038/s42003-018-0246-9.
10)	细胞（Bovine Sertoli）	荧光显微镜	E. Adegoke, S. Adeniran, Y. Zeng, X. Wang, H. Wang, C. Wang, H. Zhang, P. Zheng and G. Zhang , “Pharmacological inhibition of TLR4/NF-κB with TLR4-IN-C34 attenuated microcystin-leucine arginine toxicity in bovine Sertoli cells.”, J Appl Toxicol., 2019,doi: 10.1002/jat.3771.
11)	组织（小鼠）	荧光显微镜	E. F. Fang, Y. Hou, K. Palikaras, B. A. Adriaanse, J. S. Kerr, B. Yang, S. Lautrup, M. M. Hasan-Olive, D. Caponio, X. Dan, P. Rocktaschel, D. L. Croteau, M. Akbari, N. H. Greig, T. Fladby, H. Nilsen, M. Z. Cader, M. P. Mattson, N. Tavernarakis and V. A. Bohr, “Mitophagy inhibits amyloid-β and tau pathology and reverses cognitive deficits in models of Alzheimer’s disease.”, Nat. Neurosci. ., 2019,DOI:10.1038/s41593-018-0332-9.
12)	细胞（HepG2）	荧光显微镜	Iwasawa, T. Shinomiya, N. Ota, N. Shibata, K. Nakata, I. Shiina, and Y. Nagahara , “Novel Ridaifen-B Structure Analog Induces Apoptosis and Autophagy Depending on Pyrrolidine Side Chain”, Biological and Pharmaceutical Bulletin., 2019, 42, (3), 401-410, doi: 10.1248/bpb.b18-00643.
13)	细胞（U2OS）	荧光显微镜	T. Namba, “BAP31 regulates mitochondrial function via interaction with Tom40 within ER-mitochondria contact sites “, Sci Adv., 2019, 5, (6), 1386.
14)	细胞（INS-1）	荧光显微镜	A. Inamura, S. M. Hirayama, and K. Sakurai, Loss of Mitochondrial DNA by Gemcitabine Triggers Mitophagy and Cell Death’, Biol. Pharm. Bull.., 2019, 42, 1977.
15)	细胞（HRCEpiC, HRPTEpic）	流式细胞仪	Y. Zhao and M. Sun, Metformin rescues Parkin protein expression and mitophagy in high glucose-challenged human renal epithelial cells by inhibiting NF-κB via PP2A activation., Life Sci.., 2020, DOI:10.1016/j.lfs.2020.117382.
16)	细胞（RAES）	荧光显微镜	N. Liu, J. Wu, L. Zhang, Z. Gao, Y. Sun, M. Yu, Y. Zhao, S. Dong, F. Lu and W. Zhang , “Hydrogen Sulphide modulating mitochondrial morphology to promote mitophagy in endothelial cells under high‐glucose and high‐palmitate “, J. Cell. Mol. Med., 2017, 21, (12), 3190.
17)	细胞（BAECs）	荧光显微镜	N. Kajihara, D. Kukidome, K. Sada, H. Motoshima, N. Furukawa, T. Matsumura, T. Nishikawa and E. Araki, “Low glucose induces mitochondrial reactive oxygen species via fatty acid oxidation in bovine aortic endothelial cells”, J Diabetes Investig, 2017, 8, (6), 750.
18)	细胞（HT22）	荧光显微镜	M. Jin, H. Ni and L. Li, “Leptin Maintained Zinc Homeostasis Against Glutamate-Induced Excitotoxicity by Preventing Mitophagy-Mediated Mitochondrial Activation in HT22 Hippocampal Neuronal Cells.”, Front Neurol, 2018, 9, (9), 332.
19)	细胞（BMDMs）	流式细胞仪	D. Bhatia, K. P. Chung, K. Nakahira, E. Patino, M. C. Rice, L. K. Torres, T. Muthukumar, A. M. Choi, O. M. Akchurin and M. E. Choi , “Mitophagy-dependent macrophage reprogramming protects against kidney fibrosis”, JCI Insight, 2019, 4, (23), e132826.
20)	细胞（U2OS）	荧光显微镜	J. Zheng, D. L. Croteau, V. A. Bohr and M. Akbari, “Diminished OPA1 expression and impaired mitochondrial morphology and homeostasis in Aprataxin-deficient cells. “, Nucleic Acids Res., 2019, 47, (8), 4086.
21)	细胞（HT22）	荧光显微镜	D. D. Wang, M. F. Jin, D. J. Zhao and H. Ni, “Reduction of Mitophagy-Related Oxidative Stress and Preservation of Mitochondria Function Using Melatonin Therapy in an HT22 Hippocampal Neuronal Cell Model of Glutamate-Induced Excitotoxicity”, Front Endocrinol (Lausanne), 2019, 10, 550.
22)	细胞（CD⁴⁺T-cells, HeLa）	荧光显微镜	A. Bektas, S. H. Schurman, M. G. Freire, A. Bektas, S. H. Schurman, M. G. Freire, C. A. Dunn, A. K. Singh, F. Macian, A. M. Cuervo, R. Sen and L. Ferrucci, “Age-associated changes in human CD⁴⁺ T cells point to mitochondrial dysfunction consequent to impaired autophagy.”, Aging (Albany NY)., 2019, 11, (21), 9234-9263.
23)	细胞（ALM）	流式细胞仪	T. Nechiporuk, S.E. Kurtz, O. Nikolova, T. Liu, C.L. Jones, A. D. Alessandro, R. C. Hill, A. Almeida, S. K. Joshi, M. Rosenberg, C. E. Tognon, A. V. Danilov, B. J. Druker, B. H. Chang, S. K McWeeney and J. W. Tyner, “The TP53 Apoptotic Network Is a Primary Mediator of Resistance to BCL2 Inhibition in AML Cells.”, Cancer Discov., 2019, 9, (7), 919.
24)	细胞（PK-15）	荧光显微镜	Y. Zhang, R. Sun, X. Li and W. Fang, “Porcine Circovirus 2 Induction of ROS Is Responsible for Mitophagy in PK-15 Cells via Activation of Drp1 Phosphorylation”, Viruses., 2020, 12, (3), 289.
25)	细胞（HCE）	荧光显微镜	Y. Huo, W. Chen, X. Zheng, J. Zhao, Q. Zhang, Y. Hou, Y. Cai, X. Lu and X. Jin , “The protective effect of EGF-activated ROS in human corneal epithelial cells by inducing mitochondrial autophagy via activation TRPM2.”, J. Cell. Physiol., 2020, DOI: 10.1002/jcp.29597.
26)	细胞（心肌细胞）	荧光显微镜	Y. Sun, F. Lu, X. Yu, B. Wang, J. Chen, F. Lu, S. Peng, X. Sun, M. Yu, H. Chen, Y. Wang, L. Zhang, N. Liu, H. Du, D. Zhao and W. Zhang, “Exogenous H2S Promoted USP8 Sulfhydration to Regulate Mitophagy in the Hearts of db/db Mice.”, Aging Dis., 2020, 11, (2), 269.
27)	细胞（HCFs）	荧光显微镜	R. Tanaka, M. Umemura, M. Narikawa, M. Hikichi, K. Osaw, T. Fujita, U. Yokoyama, T. Ishigami, K. Tamura and Y. Ishikawa, “Reactive fibrosis precedes doxorubicin-induced heart failure through sterile inflammation.”, ESC Heart Fail., 2020, 7, (2), 588.
28)	细胞（VSMCs）	荧光显微镜	C. Duan, L. Kuang, X. Xiang, J. Zhang, Y. Zhu, Y. Wu, Q. Yan, L. Liu and T. Li, “Drp1 regulates mitochondrial dysfunction and dysregulated metabolism in ischemic injury via Clec16a-, BAX-, and GSH- pathways “, Cell Death Dis., 2020, 11, 251.
29)	细胞（Bovine Sertoli）	荧光显微镜	E. O. Adegoke, W. Xue, N. S. Machebe, S. O. Adeniran, W. Hao, W. Chen, Z. Han, Z. Guixue and Z. Peng, “Sodium Selenite inhibits mitophagy, downregulation and mislocalization of blood-testis barrier proteins of bovine Sertoli cell exposed to microcystin-leucine arginine (MC-LR) via TLR4/NF-kB and mitochondrial signaling pathways blockage.”, Ecotoxicol. Environ. Saf., 2018, 116, 165.
30)	细胞（HeLa）	荧光显微镜	D. Takahashi, J. Moriyama, T. Nakamura, E. Miki, E. Takahashi, A. Sato, T. Akaike, K. I. Nakama and H. Arimoto, “AUTACs: Cargo-Specific Degraders Using Selective Autophagy. “, Mol. Cell, 2019, 76, (5), 797.
31)	细胞（primary hepatocyte）	荧光显微镜	H. Kim, J. H. Lee and J. W. Park, “IDH2 deficiency exacerbates acetaminophen hepatotoxicity in mice via mitochondrial dysfunction-induced apoptosis.”, Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis, 2019, 1865, (9), 2333.
32)	细胞（C3H10T1/2s）	荧光显微镜	M. S. Rahman and Y. S. Kim, “PINK1-PRKN mitophagy suppression by Mangiferin promotes a brown-fat-phenotype via PKA-p38 MAPK signalling in murine C3H10T1/2”, Metabolism, 2020, 101, 154228.
33)	细胞（NHEKs）	荧光显微镜	S. Ikeoka and A. Kiso , “The Involvement of Mitophagy in the Prevention of UV-B-Induced Damage in Human Epidermal Keratinocytes “, J. Soc. Cosmet. Chem. Jpn., 2020, 54(3), 252.

常见问题Q&A

Q1: 本试剂盒和现存传统方法相比有何优势？

A1: 与PH敏感并基于Keima荧光蛋白检测方法相比，本试剂为小分子荧光试剂，因此无需表达荧光蛋白。

另外，可以通过与用于普通活细胞成像的荧光试剂用相同的操作方法对其进行染色和共同观察。

Q2: 使用DMSO配置后的储存液稳定性如何？

A2：Mtphagy Dye、Lyso Dye均在制备后需保存在-20℃情况下可以稳定保存1个月。建议按照实验用量，

提前分装保存。

Q3: 工作液稳定性如何

A3: 无法保存，建议现配现用。

Q4: 培养基中有酚红会影响检测吗？

A4：观察的时候，如果使用共聚焦激光显微镜的话，几乎不会受到酚红的影响，但是使用落射型荧光显微

镜的话，会观察到酚红色的背景。（参照以下观察数据）因此使用落射型荧光显微镜时，请在Working

solution进行染色时使用不含酚红的培养基或HBSS。

线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01

Q5: 荧光显微镜推荐的滤镜是什么？

A5:根据各种试剂推荐以下波长。Mtphagy Dye：激发（500～560 nm）、发射（670～730 nm）

Lyso Dye：激发（350～450 nm）、发射（500～560 nm）

Q6:与其他深红色染料共同染色时的注意事项。

A6：Mtphagy Dye比一般的红色系荧光染料相比波长更长，所以和Deep Red的荧光染料一起染色的时候

需要特别注意。即Mtphagy Dye在500–560 nm处激发，可在670-730 nm处检测到荧光，这时与

MitoBright Deep Red的荧光检测波长重叠。因此，有必要在不激发深红色染料的波长下激发Mtphagy

染料，同时在不激发Mtphagy染料的波长下激发深红色染料。

[泄漏的情况]

① 制备仅添加了MitoBright Deep Red（没有添加Mtphagy Dye）的细胞。

② 通过观察MitoBright Deep Red的激发/发射波长，确认是否观察到荧光（右下图）。

③ 用Mtphagy Dye的激发/发射波长观察，确认是否观察到荧光（左下图）。

和③中，观察到来自MitoBright Deep Red的荧光（左下图）。

*如果如上所述确认荧光泄漏，请参阅以下内容。

○调整激发/发射波长

如以上确认如图所示，MitoBright Deep Red也在Ex 561 nm处激发，因此可以将Mtphagy Dye的激发

波长更改为接近激光器或滤光片的500 nm，以使MitoBright深红色不被激发。

调整荧光强度和荧光检测灵敏度

如果MitoBright Deep Red的荧光泄漏到Mtphagy染料的观察波长中，请将观察过程中的激发强度或

灵敏度降低到未观察到荧光的水平。

然后，再确认改变后的观察条件下可以检测Mtphagy Dye的荧光。

[如何检查泄漏]

使用Mtphagy Dye，Lyso dye（溶酶体染色剂），MitoBrightLT Deep Red（线粒体染色剂）

进行三重染色时进行确认

1.在3个培养皿或孔中制备细胞。

（Mtphagy Dye、Lyso Dye、MitoBright Deep Red分别在在不同的皿或孔中进行染色）

2.向每个孔中添加Mtphagy Dye和MitoBright Deep Red。（在无血清培养基中）

3.在37°C下孵育30分钟。

4.进行自噬诱导条件下（如饥饿培养等）进行培养。

5.向上述2.中未使用的细胞添加Lyso Dye。（在无血清培养基中）

6.在37°C下孵育30分钟。

7.观察每种试剂的激发波长和荧光波长以及荧光强度。

8.检查所用试剂以外的观察波长处的荧光是否没有泄漏。

[观察条件]

Lyso Dye：Ex：350-450 nm，Em：500-560 nm

Mtphagy Dye：Ex ： 500-560 nm，Em ：670-730 nm

MitoBright Deep Red：Ex ：640 nm，Em ：656-700 nm

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