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关联产品
实验工具|稀释计算器|摩尔浓度计算器
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特点:
● 荧光素标记的产品可以在大约2小时内制备。
● 可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
● 可以标记50至200μg的蛋白质。
● 可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
● 荧光素标记的物体可以与所附的存储溶液一起存储。
试剂盒内含
产品概述
NH2-reactive HiLyte FluorTM 647是试剂盒的成分之一,它有一个琥珀酰亚胺基(NHS),能与蛋白质或者其它分子的氨基反应。该试剂盒中包含了标记所需的全部试剂。每一管NH2-reactive HiLyte FluorTM 647最多能够标记200 μg的IgG,每个IgG分子可与4-6个HiLyte FluorTM 647分子共价结合。标记过程十分简单,只需要在特制的过滤膜上将NH2-reactive HiLyte FluorTM 647加入到IgG溶液中,然后在37℃下培养10分钟。过量的HiLyte FluorTM 647能够用过滤管除去。被HiLyte FluorTM 647标记后的IgG的激发和发射波长分别为652 nm和673 nm。
* HiLyte FluorTM为AnaSpec,Inc公司的商标
原理
荧光特性
操作步骤
使用注意事项:
1. 用该试剂盒标记的蛋白质的分子量要>50,000。
2. 在标记过程中,IgG或者HiLyte FluorTM 647-IgG标记物始终在Filtration tube的滤膜上。
3. 如果IgG溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质,如BSA或明胶时,在使用该试剂盒标记前,先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits(不包含于本试剂盒 中)来纯化。
4. 如果IgG溶液含有小的不溶物,离心后取上清液来进行标记。
5. 如果长时间不使用,建议您把试剂盒中的标记试剂NH2-reactive HiLyte FluorTM 647放在-20℃冰箱中保存,不需要充氮气,可以更好地保持标记试剂的活性,但请不要把其它试剂和过滤管放到-20℃冰箱中,仍请放在0-5℃冰箱中保存。
标记IgG操作步骤
(1)将100μl WS buffer以及含有100μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a)
(2)8,000-10,000g离心10分钟。b)
(3)将10μl DMSO加入到NH2-reactive HiLyte FluorTM647中并用移液器吹打使其溶解。c)
(4)将100μl Reaction buffer以及8μl NH2-reactive HiLyte FluorTM647溶液加入到过滤管中,吹打使其混合。d)
(5)将过滤管放入培养箱中,37℃培养10分钟。
(6)将100μl WS buffer加入到过滤管中,8,000-10,000g离心10分钟,b)除去滤液。
(7)将200μl WS buffer加入到过滤管中,8,000g离心10分钟,b)重复该步骤一次。
(8)将200μl WS buffer加入到过滤管中吹打10-15次来回收标记产物。e)将该溶液转移到0.5ml试管中,在0-5℃下保存。
a)样品溶液的体积不应超过100μl。如果抗体浓度低于1mg/ml,重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到100μg。如果聚积过程中滤液的体积超过400μl,则在进行后续的离心操作前应除去滤液。
b)如果溶液在离心后仍然残留在膜上,可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c)NH2-reactive HiLyte FluorTM647在管子的底部,向管底加入10μl DMSO,吹打数次使其溶解。
d)如果IgG的量为200μg,加入所有的NH2-reactive HiLyte FluorTM647溶液。
e)并不一定要使用WS buffer来回收标记产物,可以选择任何适合于该实验的缓冲液来替代。
产品优势
1)荧光素标记的产品可以在大约2小时内制备。
2)可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
3)可以标记50至200μg的蛋白质。
4)可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
5)荧光素标记的物体可以与所附的存储溶液一起存储。
常见问题Q&A
Q1:能够用这个试剂盒标记其他蛋白质吗? |
A:可以。只要标记分子的分子量>50,000。 |
Q2:标记蛋白之前是否必须使用过滤管? |
A:如果蛋白溶液中不含有带有活性氨基的小分子且蛋白浓度在10 mg/ml或者70 μM左右时,可以不使用过滤管来过滤,只需要将10 μl 样品溶液和90 μl Reaction Buffer以及8 μl NH2-reactive HiLyte FluorTM 555(由步骤3所得)混合并按照操作说明上的方法做从步骤4开始的后续试验。 |
Q3:能够使用这个试剂盒标记寡核苷酸或者寡肽吗? |
A:不行。寡核苷酸或者寡肽可能因为分子量太小而不能存在于滤膜上。 |
Q4:用该试剂盒所能标记的IgG的最小量是多少? |
A:IgG的最小量为10 μg。IgG的量在10 μg-100 μg之间时,标记比率是相同的。 |
Q5:标记产物能保存多久? |
A:在4℃下能够保存2个月。如果需要保存更久,可以添加等量的丙三醇,并在-20℃下存放。但是,还要注意样品自身是否稳定。 |
参考文献
1) S. Hiroyasu, T. Ozawa, H. Kobayashi, M. Ishii, Y. Aoyama, Y. Kitajima, T. Hashimoto, J.C.R. Jones and D. Tsuruta, “Bullous pemphigoid IgG induces BP180 internalization via a macropinocytic pathway”, Am. J. Pathol.., 2013, 182, (3), 828. |
2) W. Jin, K. Yamada, M. Ikami, N. Kaji, M. Tokeshi, Y. Atsumi, M. Mizutani, A. Murai, A. Okamoto, T. Namikawa, Y. Baba, M. Ohta, “Application of IgY to sandwich enzyme-linked immunosorbent assays, lateral flow devices, and immunopillar chips for detecting staphylococcal enterotoxins in milk and dairy products”, J. Microbiol. Methods., 2013, 92, (3), 323. |
3) Y. Hayashi, M. Okutani, S. Ogawa, T. Tsukahara, R. Inoue, “Generation of anti-porcine CD69 monoclonal antibodies and their usefulness to evaluate early activation of cellular immunity by flow cytometric analysis”, Anim. Sci. J.., 2018, 89, (5), 825. |
4) T. Kojima, J. Hata, H. Oka, K. Hayashi, K. Hitomi and H. Nakano, “Spatial arrangement of proteins using scCro-tag: application for an in situ enzymatic microbead assay.”, Biosci. Biotechnol. Biochem., 2018, 82, (11), 1911. |
5) S. Mawaribuchi, Y. Haramoto, H. Tateno, Y. Onuma, Y. Aiki and Y. Ito, “rBC2LCN lectin as a potential probe of early-stage HER2-positive breast carcinoma.”, FEBS Open Bio., 2020, DOI: 10.1002/2211-5463.12852. |
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特点:
● 荧光素标记的产品可以在大约2小时内制备。
● 可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
● 可以标记50至200μg的蛋白质。
● 可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
● 荧光素标记的物体可以与所附的存储溶液一起存储。
试剂盒内含
产品概述
该试剂盒主要用于制备红色荧光标记的蛋白质,如免疫转染中的IgG和示踪用胞内蛋白。用NH2-reactive HiLyte FluorTM 555是试剂盒的成分之一,它有一个琥珀酰亚胺基(NHS),能与蛋白质或者其它分子的氨基反应。该试剂盒中包含了标记所需的全部试剂。每一管NH2-reactive HiLyte FluorTM 555最多能够标记200μg的IgG,每个IgG分子与4-6个HiLyte FluorTM 555分子共价结合。标记过程十分简单,只需要在特制的过滤膜上将NH2-reactive HiLyte FluorTM 555加入到IgG溶液中,然后在37℃下培养10分钟。过量的HiLyte FluorTM 555能够用过滤管除去。被HiLyte FluorTM 555标记后的IgG的激发和发射波长分别为555nm和570nm。
* HiLyte FluorTM 为AnaSpec,Inc公司的商标
原理
荧光特性
操作步骤
使用注意事项:
1. 用该试剂盒标记的蛋白质的分子量要>50,000。
2. 在标记过程中,IgG或者HiLyte FluorTM 555-IgG标记物始终在Filtration tube的滤膜上。。
3. 如果IgG溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质,如BSA或明胶时,在使用该试剂盒标记前,先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits(不包含于本试剂盒 中)来纯化。
4. 如果IgG溶液含有小的不溶物,离心后取上清液来进行标记。
5. 如果长时间不使用,建议您把试剂盒中的标记试剂NH2-reactive HiLyte FluorTM 555放在-20℃冰箱中保存,不需要充氮气,可以更好地保持标记试剂的活性,但请不要把其它试剂和过滤管放到-20℃冰箱中,仍请放在0-5℃冰箱中保存。
标记IgG操作步骤:
(1)将100μl WS buffer以及含有100μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a)
(2)8,000-10,000g离心10分钟。 b)
(3)将10μl DMSO加入到NH2-reactive HiLyte FluorTM 555中并用移液器吹打使其溶解。c)
(4)将100μl Reaction buffer以及8μl NH2-reactive HiLyte FluorTM 555溶液加入到过滤管中,吹打使其混合。d)
(5)将过滤管放入培养箱中,37℃培养10分钟。
(6)将100μl WS buffer加入到过滤管中,8,000-10,000g离心10分钟,b)除去滤液。
(7)将200μl WS buffer加入到过滤管中,8,000g离心10分钟,b)重复该步骤一次。
(8)将200μl WS buffer加入到过滤管中吹打10-15次来回收标记产物。e)将该溶液转移到0.5ml试管中,在0-5℃下保存。
a)样品溶液的体积不应超过100μl。如果抗体浓度低于1mg/ml,重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到100μg。如果聚积过程中滤液的体积超过400μl,则在进行后续的离心操作前应除去滤液。
b)如果溶液在离心后仍然残留在膜上,可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c)NH2-reactive HiLyte FluorTM 555在管子的底部,向管底加入10μl DMSO,吹打数次使其溶解。
d)如果IgG的量为200μg,加入所有的NH2-reactive HiLyte FluorTM 555溶液。
e)并不一定要使用WS buffer来回收标记产物,可以选择任何适合于该实验的缓冲液来替代。
产品优势
1)荧光素标记的产品可以在大约2小时内制备。
2)可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
3)可以标记50至200μg的蛋白质。
4)可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
5)荧光素标记的物体可以与所附的存储溶液一起存储。
常见问题Q&A
Q1:能够用这个试剂盒标记其他蛋白质吗? |
A:可以。只要标记分子的分子量>50,000。 |
Q2:标记蛋白之前是否必须使用过滤管? |
A:如果蛋白溶液中不含有带有活性氨基的小分子且蛋白浓度在10 mg/ml或者70 μM左右时,可以不使用过滤管来过滤,只需要将10 μl 样品溶液和90 μl Reaction Buffer以及8 μl NH2-reactive HiLyte FluorTM 555(由步骤3所得)混合并按照操作说明上的方法做从步骤4开始的后续试验。 |
Q3:能够使用这个试剂盒标记寡核苷酸或者寡肽吗? |
A:不行。寡核苷酸或者寡肽可能因为分子量太小而不能存在于滤膜上。 |
Q4:用该试剂盒所能标记的IgG的最小量是多少? |
A:IgG的最小量为10 μg。IgG的量在10 μg-100 μg之间时,标记比率是相同的。 |
Q5:标记产物能保存多久? |
A:在4℃下能够保存2个月。如果需要保存更久,可以添加等量的丙三醇,并在-20℃下存放。但是,还要注意样品自身是否稳定。 |
参考文献
1)A. Nagao, K. Sato, K.M. Nishida, H. Siomi, M.C. Siomi, “Gender-specific hierarchy in nuage localization of PIWI-interacting RNA factors in Drosophila”, Front Genet.,2011, 2, 55. |
2) H. Hoshino, G. Shioi, S. Aizawa, “AVE protein expression and visceral endoderm cell behavior during anterior–posterior axis formation in mouse embryos: Asymmetry in OTX2 and DKK1 expression”, Dev. Biol.., 2015, 402, (2), 175. |
3) T. Kaneko, T. Minohara, S. Shima, K. Yoshida, A. Fukuda, N. Iwamori, T. Inai and H. Iida, “A membrane protein, TMCO5A, has a close relationship with manchette microtubules in rat spermatids during spermiogenesis”, Mol. Reprod. Dev.., 2019, 86, (3), 330. |
4) Y. Nakashima, T. Mima, M. Yashiro, T. Sonou, M. Ohya, A. Masumoto, S. Yamanaka, D. Koreeda, K. Tatsuta, Y. Hanba, M. Moribata, S. Negi, T. Shigematsu, “Expression and localization of fibroblast growth factor (FGF) 23 and Klotho in the spleen: its physiological and functional implications”, Growth Factors ., 2016, 34, (5-6), 196. |
5) Z. Zhang, K. Kakutani, K. Maeno, T. Takada, T. Yurube, M. Doita, M. Kurosaka and K. Nishida, “Expression of silent mating type information regulator 2 homolog 1 and its role in human intervertebral disc cell homeostasis”, Arthritis Res. Ther.., 2011, 13, (6), R200. |
6) I. Hasan, M. Gerdol, Y. Fujii and Y. Ozeki, “Functional Characterization of OXYL, A SghC1qDC LacNAc-specific Lectin from The Crinoid Feather Star Anneissia Japonica.”, Mar Drugs., 2019, 17, DOI:10.3390/md17020136. |
7)Y. Fujii, M. Gerdol, S.M.A. Kawsar, I. Hasan, F. Spazzali, T. Yoshida, Y. Ogawa, S. Rajia, K. Kamata, Y. Koide, S. Sugawara, M. Hosono, J.R.H. Tame, H. Fujita, A. Pallavicini and Y. Ozeki, “A GM1b/asialo-GM1 oligosaccharide-binding R-type lectin from purplish bifurcate mussels Mytilisepta virgata and its effect on MAP kinases.”, FEBS J., 2019, DOI: 10.1111/febs.15154. |
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容 量 | メーカー希望 小売価格 |
富士フイルム 和光純薬 |
---|---|---|
3 samples | ¥26,200 | 348-91041 |
サンプル量 | 50-200 µg |
---|---|
所要時間 | 2時間 |
標識部位 | -NH2 |
検出方法 | 顕微鏡・FCM |
蛍光特性 | [Ex:555, Em:570] |
・分子量50,000以上のタンパク質が標識できる。 ・Filtration Tubeを用いた分離操作により高い回収率で標識体が得られる。 ・付属の保存溶液でHiLyte Fluor™標識体の保存ができる。 |
3 samples | ・NH2-Reactive Hilyte FluorTM 555 ・WS Buffer ・Reaction Buffer ・Filtration Tube |
3 tubes 4 ml x1 500 μl x1 3 tubes |
---|
1) 約2時間でHiLyte FluorTM標識体が調製できる。
2) 分子量50,000以上のタンパク質が標識できる。
3) 50~200 μgのタンパク質を標識可能である。
4) Filtration Tubeを用いた分離操作により高い回収率で標識体が得られる。
5) 付属の保存溶液でHiLyte FluorTM標識体の保存ができる。
*HiLyte FluorTMはAnaSpec 社の商標です。同仁化学では試験・研究用として許諾を得ております。
1) A. Nagao, K. Sato, K.M. Nishida, H. Siomi, M.C. Siomi, "Gender-specific hierarchy in nuage localization of PIWI-interacting RNA factors in Drosophila", Front Genet.,2011, 2, 55.
2) H. Hoshino, G. Shioi, S. Aizawa, "AVE protein expression and visceral endoderm cell behavior during anterior–posterior axis formation in mouse embryos: Asymmetry in OTX2 and DKK1 expression", Dev. Biol.., 2015, 402, (2), 175.
3) T. Kaneko, T. Minohara, S. Shima, K. Yoshida, A. Fukuda, N. Iwamori, T. Inai and H. Iida, "A membrane protein, TMCO5A, has a close relationship with manchette microtubules in rat spermatids during spermiogenesis", Mol. Reprod. Dev.., 2019, 86, (3), 330.
4) Y. Nakashima, T. Mima, M. Yashiro, T. Sonou, M. Ohya, A. Masumoto, S. Yamanaka, D. Koreeda, K. Tatsuta, Y. Hanba, M. Moribata, S. Negi, T. Shigematsu, "Expression and localization of fibroblast growth factor (FGF) 23 and Klotho in the spleen: its physiological and functional implications", Growth Factors ., 2016, 34, (5-6), 196.
5) Z. Zhang, K. Kakutani, K. Maeno, T. Takada, T. Yurube, M. Doita, M. Kurosaka and K. Nishida, "Expression of silent mating type information regulator 2 homolog 1 and its role in human intervertebral disc cell homeostasis", Arthritis Res. Ther.., 2011, 13, (6), R200.
6) I. Hasan, M. Gerdol, Y. Fujii and Y. Ozeki, "Functional Characterization of OXYL, A SghC1qDC LacNAc-specific Lectin from The Crinoid Feather Star Anneissia Japonica.", Mar Drugs., 2019, 17, DOI:10.3390/md17020136.
7)Y. Fujii, M. Gerdol, S.M.A. Kawsar, I. Hasan, F. Spazzali, T. Yoshida, Y. Ogawa, S. Rajia, K. Kamata, Y. Koide, S. Sugawara, M. Hosono, J.R.H. Tame, H. Fujita, A. Pallavicini and Y. Ozeki, "A GM1b/asialo-GM1 oligosaccharide-binding R-type lectin from purplish bifurcate mussels Mytilisepta virgata and its effect on MAP kinases.", FEBS J., 2019, DOI: 10.1111/febs.15154.
Labeling Kitで1次抗体を直接標識する利点を教えてください。
はじめて抗体標識をされる方を対象としたプロトコルを作成しております。
カスタマーサポートの視点から直接標識法の利点や実施例等を記載しておりますので、ご参照下さい。
下記リンクよりダウンロード可能です。
「はじめての抗体標識プロトコル ~カスタマーサポートの視点から~」
サンプル溶液中の共存物は反応に影響しますか?
共存物の種類により影響することがあります。
溶液中にどのような物質が含まれるかを確認の上、状況に応じてラベル化に用いるサンプルの精製を行い、標識反応にご使用ください。
<高分子:分子量1万以上>
影響する可能性があります。
BSAやゼラチンなどアミノ基をもつ化合物が含まれると、抗体への標識効率が低下します。また、高分子のためFiltration Tubeでも除くことができません。また、アミノ基を持たない化合物でも、高分子の不純物が多いとフィルターの目詰まりの原因になり、標識・精製操作に支障がでる可能性もあります。反応に使用する前に別途精製を行ってください。
*本製品に限らず他のLabeling kit に関しても同様の注意が必要です。
サンプルが溶液でも問題ないでしょうか?
溶液であること自体は問題ありません。
ただし、下記の点をご確認いただいた上でご使用ください。
-濃度-
サンプル濃度が0.5mg/ml以下(50μg/100μl以下)である場合には
Filtration tubeを用いてサンプル量が50~200μgとなるように
遠心して濃縮を行ってください。
フィルター上に残ったサンプルは再溶解させる必要はありません。
そのまま反応にご使用ください。
-溶液量-
Filtration tubeの容量に制限がありますので、溶液の量は100μl以下でご使用ください。
-共存物-
・不溶性の低分子が含まれる場合は、予め遠心して上清のみを使用してください。
・分子量10,000以上の物質が含まれる場合には、別途精製を行ってからご使用ください。
(市販の抗体の中には安定化剤としてBSAやアルブミンを含む場合があります)
光による退色は起こりにくいのでしょうか?
当社での確認試験では、HiLyte Fluor 555, HiLyte Fluor 647ともにAlexaと同等の耐光性を示しています。
低分子のタンパク質(分子量50,000以下)に標識する場合の方法を教えて下さい。
キット付属のフィルトレーションチューブは分画分子量30Kの限外濾過フィルターのため、余裕をもって50,000以上のタンパク質のご使用を推奨しております。
分子量50,000以下のタンパク質を標識される場合は、下記のような分画分子量の小さい限外濾過フィルターに変更して頂くことで、低分子のタンパク質でもラベル化可能でございます。
——————————————
PALL社 ナノセップ 3K 製品No.OD003C33
PALL社 ナノセップ 10K 製品No.OD010C33
——————————————
キット同梱のフィルターを用いた場合に比べ遠心に時間を要することがございますので遠心時間はご検討下さい。
標識後、フィルトレーションチューブを遠心してもメンブレン上に液が残る。
(1)メンブレンを目視で確認した際、メンブレンカップの淵にうっすら液が残る程度であれば、次の操作に進んで下さい。
メンブレン上に液が残っていたり、メンブレンカップを傾けて回転させたとき、液が垂れてくるようであれば、さらに遠心を8,000g で15分~30分程度行って下さい。
(2)1)の遠心操作後もメンブレン上に液が残る場合は、標識体が凝集していないか確認してください。
抗体やタンパク質自身の性質によりますが、低分子標識剤を標識することで抗体やタンパク質の疎水性が増し、凝集する場合がございます。
標識体に凝集が見られる場合は、一度別のマイクロチューブに移し、遠心し上澄みをご使用ください。(抗体・タンパク質の回収量は低下いたします。)
上記でも解決しない場合は、小社カスタマーサポートまでお問い合わせください。
※フィルターの目詰まりが疑われる場合は、メンブレンフィルターを新しいものに交換すると解決する場合がございます。
代替品: PALL社製 ナノセップ 30K (メーカーコード:OD030C33)
IgG1分子に色素が幾つ標識されますか?
IgG1分子あたり、3~7個の色素が標識されます。
プロトコルや製品添付の説明書にも標識率を計算する式を載せてあります。
HiLyte Fluor 555/タンパク質の標識率=[A555/150,000]/[(A280-A555x0.1)/ε]
A555:555nmの吸光度
A280:280nmの吸光度
ε:タンパク質の280nmのモル吸光係数(IgGの場合には216,000)
未反応の色素は除去できますか?
説明書にある反応後の2回の洗浄で、未反応色素の95%は除去されます。
必要であれば、WS buffer等での洗浄をさらに2~3回繰り返すことで未反応色素はほぼ除去されます。
保存条件: 冷蔵 , 取扱条件: 吸湿注意 |
この製品に関連する研究では、下記の関連製品も使われています。
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容 量 | メーカー希望 小売価格 |
富士フイルム 和光純薬 |
---|---|---|
3 samples | ¥27,700 | 345-91051 |
サンプル量 | 50-200 µg |
---|---|
所要時間 | 2時間 |
標識部位 | -NH2 |
検出方法 | 顕微鏡・FCM |
蛍光特性 | [Ex:655, Em:670] |
・分子量50,000以上のタンパク質が標識できる。 ・Filtration Tubeを用いた分離操作により抗体の場合は高い回収率で標識体が得られる。 ・付属の保存溶液でHiLyte Fluor™標識体の保存ができる。 |
3 samples | ・NH2-Reactive Hilyte FluorTM 647 ・WS Buffer ・Reaction Buffer ・Filtration Tube |
3 tubes 4 ml×1 500 μl×1 3 tubes |
---|
1) 約2時間でHiLyte FluorTM標識体が調製できる。
2) 分子量50,000以上のタンパク質が標識できる。
3) 50~200 μgのタンパク質を標識可能である。
4) Filtration Tubeを用いた分離操作により抗体の場合は高い回収率で標識体が得られる。
5) 付属の保存溶液でHiLyte FluorTM標識体の保存ができる。
*HiLyte FluorTMはAnaSpec 社の商標です。同仁化学では試験・研究用として許諾を得ております。
1) S. Hiroyasu, T. Ozawa, H. Kobayashi, M. Ishii, Y. Aoyama, Y. Kitajima, T. Hashimoto, J.C.R. Jones and D. Tsuruta, "Bullous pemphigoid IgG induces BP180 internalization via a macropinocytic pathway", Am. J. Pathol.., 2013, 182, (3), 828.
2) W. Jin, K. Yamada, M. Ikami, N. Kaji, M. Tokeshi, Y. Atsumi, M. Mizutani, A. Murai, A. Okamoto, T. Namikawa, Y. Baba, M. Ohta, "Application of IgY to sandwich enzyme-linked immunosorbent assays, lateral flow devices, and immunopillar chips for detecting staphylococcal enterotoxins in milk and dairy products", J. Microbiol. Methods., 2013, 92, (3), 323.
3) Y. Hayashi, M. Okutani, S. Ogawa, T. Tsukahara, R. Inoue, "Generation of anti-porcine CD69 monoclonal antibodies and their usefulness to evaluate early activation of cellular immunity by flow cytometric analysis", Anim. Sci. J.., 2018, 89, (5), 825.
4) T. Kojima, J. Hata, H. Oka, K. Hayashi, K. Hitomi and H. Nakano, "Spatial arrangement of proteins using scCro-tag: application for an in situ enzymatic microbead assay.", Biosci. Biotechnol. Biochem., 2018, 82, (11), 1911.
5) S. Mawaribuchi, Y. Haramoto, H. Tateno, Y. Onuma, Y. Aiki and Y. Ito, "rBC2LCN lectin as a potential probe of early-stage HER2-positive breast carcinoma.", FEBS Open Bio., 2020, DOI: 10.1002/2211-5463.12852.
Labeling Kitで1次抗体を直接標識する利点を教えてください。
はじめて抗体標識をされる方を対象としたプロトコルを作成しております。
カスタマーサポートの視点から直接標識法の利点や実施例等を記載しておりますので、ご参照下さい。
下記リンクよりダウンロード可能です。
「はじめての抗体標識プロトコル ~カスタマーサポートの視点から~」
サンプル溶液中の共存物は反応に影響しますか?
共存物の種類により影響することがあります。
溶液中にどのような物質が含まれるかを確認の上、状況に応じてラベル化に用いるサンプルの精製を行い、標識反応にご使用ください。
<高分子:分子量1万以上>
影響する可能性があります。
BSAやゼラチンなどアミノ基をもつ化合物が含まれると、抗体への標識効率が低下します。また、高分子のためFiltration Tubeでも除くことができません。また、アミノ基を持たない化合物でも、高分子の不純物が多いとフィルターの目詰まりの原因になり、標識・精製操作に支障がでる可能性もあります。反応に使用する前に別途精製を行ってください。
*本製品に限らず他のLabeling kit に関しても同様の注意が必要です。
サンプルが溶液でも問題ないでしょうか?
溶液であること自体は問題ありません。
ただし、下記の点をご確認いただいた上でご使用ください。
-濃度-
サンプル濃度が0.5 mg/ml以下(50 μg/100 μl以下)である場合には
Filtration tubeを用いてサンプル量が50~200 μgとなるように
遠心して濃縮を行ってください。
フィルター上に残ったサンプルは再溶解させる必要はありません。
そのまま反応にご使用ください。
-溶液量-
Filtration tubeの容量に制限がありますので、溶液の量は100μl以下でご使用ください。
-共存物-
・不溶性の低分子が含まれる場合は、予め遠心して上清のみを使用してください。
・分子量10,000以上の物質が含まれる場合には、別途精製を行ってからご使用ください。
(市販の抗体の中には安定化剤としてBSAやアルブミンを含む場合があります)
光による退色は起こりにくいのでしょうか?
当社での確認試験では、HiLyte Fluor 555, HiLyte Fluor 647ともにAlexaと同等の耐光性を示しています。
低分子のタンパク質(分子量50,000以下)に標識する場合の方法を教えて下さい。
キット付属のフィルトレーションチューブは分画分子量30Kの限外濾過フィルターのため、
余裕をもって50,000以上のタンパク質のご使用を推奨しております。
分子量50,000以下のタンパク質を標識される場合は、
下記のような分画分子量の小さい限外濾過フィルターに変更して
頂くことで、低分子のタンパク質でもラベル化可能でございます。
——————————————
PALL社 ナノセップ 3K 製品No.OD003C33
PALL社 ナノセップ 10K 製品No.OD010C33
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キット同梱のフィルターを用いた場合に比べ遠心に時間を要することが
ございますので遠心時間はご検討下さい。
標識後、フィルトレーションチューブを遠心してもメンブレン上に液が残る。
(1)メンブレンを目視で確認した際、メンブレンカップの淵にうっすら液が残る程度であれば、
次の操作に進んで下さい。
メンブレン上に液が残っていたり、メンブレンカップを傾けて回転させたとき、液が
垂れてくるようであれば、さらに遠心を8,000g で15分~30分程度行って下さい。
(2)1)の遠心操作後もメンブレン上に液が残る場合は、標識体が凝集していないか確認してください。
抗体やタンパク質自身の性質によりますが、低分子標識剤を
標識することで抗体やタンパク質の疎水性が増し、凝集する場合がございます。
標識体に凝集が見られる場合は、一度別のマイクロチューブに移し、遠心し上澄みを
ご使用ください。(抗体・タンパク質の回収量は低下いたします。)
上記でも解決しない場合は、小社カスタマーサポートまでお問い合わせください。
※フィルターの目詰まりが疑われる場合は、メンブレンフィルターを新しいものに
交換すると解決する場合がございます。
代替品: PALL社製 ナノセップ 30K (メーカーコード:OD030C33)
IgG1分子に色素が幾つ標識されますか?
IgG1分子あたり、3~7個の色素が標識されます。
プロトコルや製品添付の説明書にも標識率を計算する式を載せてあります。
HiLyte Fluor 647/タンパク質の標識率=[A655/250,000]/[(A280-A655x0.05)/ε]
A655:655nmの吸光度
A280:280nmの吸光度
ε:タンパク質の280nmのモル吸光係数(IgGの場合には216,000)
未反応の色素は除去できますか?
説明書にある反応後の2回の洗浄で、未反応色素の95%は除去できます。
必要であれば、WS buffer等での洗浄をさらに2~3回繰り返すことで未反応色素はほぼ除去されます。
保存条件: 冷蔵 , 取扱条件: 吸湿注意 |
この製品に関連する研究では、下記の関連製品も使われています。
上海金畔生物科技有限公司代理日本同仁化学试剂盒全线产品,欢迎访问日本同仁化学dojindo官网了解更多信息。
容 量 | メーカー希望 小売価格 |
富士フイルム 和光純薬 |
---|---|---|
3 samples | ¥27,300 | 347-91991 |
サンプル量 | 10 µg (lgG) |
---|---|
所要時間 | 30分以内 |
標識部位 | -NH2 |
検出方法 | 顕微鏡・FCM |
蛍光特性 | [Ex:555, Em:570] |
3 samples | ・Reactive Hilyte FluorTM 555 ・Reaction Buffer ・Stop Solution |
x3 100 μl×1 100 μl×1 |
---|
※ 本製品の標識操作により、抗体中のアミノ基に標識体が結合します。そのため抗体によっては抗原認識能が失われる場合がございます。
ご不明な点がありましたら小社カスタマーサポートへお問合せ下さい。
※ 抗体サンプル中の添加剤によっては標識に影響を与えることがあります。詳しくは取扱説明書にてご確認ください。
ご注意:容量別で取扱説明書が違うため、お使いの製品容量をご確認ください。
抗体溶液中に含まれる添加剤は標識反応に影響しますか?
抗体溶液中の添加剤によっては影響を受ける場合がございますので、ご使用前に必ず取り扱い説明書中の注意事項をご確認ください。
標識にはどのようなサンプルが使用できますか?
10 μgのIgG抗体をご使用頂けます。
使用可能な抗体のクラスには、どのようなものがありますか?
本製品はIgG抗体へ標識するよう最適化しています。IgG以外のクラス(IgMやIgA等)では標識実績はございません。
直接標識することで免疫染色に影響がみられた抗体種はありますか?
抗体の種類によっては直接標識法(1次抗体法)により抗原認識能を失うことがあります。抗原認識部位またはその近傍にアミノ基が存在した場合に、その部分に標識体が結合することで抗原認識能が低下することが考えられます。
弊社で確認した抗体のうち、直接標識することで免疫染色に問題が生じた抗体をご案内いたします。
抗体名 | 由来 | クローナリティ |
---|---|---|
Anti-VDAC1 antibody | Rabbit | ポリクローナル |
Anti-EEA1 antibody | Rabbit | ポリクローナル |
Anti-α-actin antibody | Mouse | モノクローナル |
Anti-LAMP 1 antibody | Mouse | モノクローナル |
Anti-Calnexin Antibody | Rabbit | ポリクローナル |
非特異な染色やバックグラウンドが見られます。どうしたらいいですか?
抗体によっては、非特異な染色やバックグラウンドが見られることがあり、Stop solutionの添加量を増やすことで改善する場合があります。Stop solutionの添加量は上限30μlを目安にご検討ください。改善されない場合は、直接標識法(1次抗体法)により抗抗原認識能が低下した可能性が考えられます。「直接標識することで免疫染色に影響がみられた抗体種はありますか?」をご参照ください。
保存条件: 冷蔵 , 取扱条件: 吸湿注意 |
この製品に関連する研究では、下記の関連製品も使われています。
上海金畔生物科技有限公司代理日本同仁化学试剂盒全线产品,欢迎访问日本同仁化学dojindo官网了解更多信息。
容 量 | メーカー希望 小売価格 |
富士フイルム 和光純薬 |
---|---|---|
3 samples | ¥27,300 | 344-92001 |
サンプル量 | 10 µg (lgG) |
---|---|
所要時間 | 30分以内 |
標識部位 | -NH2 |
検出方法 | 顕微鏡・FCM |
蛍光特性 | [Ex:655, Em:670] |
3 samples | ・Reactive Hilyte FluorTM647 ・Reaction Buffer ・Stop Solution |
x 3 100 μl x 1 100 μl x 1 |
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1) 少量の抗体 (10 μg) にHiLyte Fluor™ 647を標識可能
2) 抗体と混ぜるだけの簡便な操作
3) 30分以内に標識可能
1)K. Bandow, H. Hasegawa, M. Tomomura and A. Tomomura, "Caldecrin inhibits lipopolysaccharide-induced pro-inflammatory cytokines and M1 macrophage polarization through the immunoreceptor triggering receptor expressed in myeloid cells-2", Biochem. Biophys. Res. Commun., 2020, doi:10.1016/j.bbrc.2020.01.045.
2)R. Ueki, S. Uchida, N. Kanda, N. Kanda, N. Yamada, A. Ueki, M. Akiyama, K. Toh, H. Cabral and S. Sando, "A chemically unmodified agonistic DNA with growth factor functionality for in vivo therapeutic application", Sci. Adv., 2020, 6, 14.
抗体溶液中に含まれる添加剤は標識反応に影響しますか?
抗体溶液中の添加剤によっては影響を受ける場合がございますので、ご使用前に必ず取り扱い説明書中の注意事項をご確認ください。
標識にはどのようなサンプルが使用できますか?
10 μgのIgG抗体をご使用頂けます。
使用可能な抗体のクラスには、どのようなものがありますか?
本製品はIgG抗体へ標識するよう最適化しています。IgG以外のクラス(IgMやIgA等)では標識実績はございません。
直接標識することで免疫染色に影響がみられた抗体種はありますか?
抗体の種類によっては直接標識法(1次抗体法)により抗原認識能を失うことがあります。抗原認識部位またはその近傍にアミノ基が存在した場合に、その部分に標識体が結合することで抗原認識能が低下することが考えられます。
弊社で確認した抗体のうち、直接標識することで免疫染色に問題が生じた抗体をご案内いたします。
抗体名 | 由来 | クローナリティ |
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Anti-VDAC1 antibody | Rabbit | ポリクローナル |
Anti-EEA1 antibody | Rabbit | ポリクローナル |
Anti-α-actin antibody | Mouse | モノクローナル |
Anti-LAMP 1 antibody | Mouse | モノクローナル |
Anti-Calnexin Antibody | Rabbit | ポリクローナル |
非特異な染色やバックグラウンドが見られます。どうしたらいいですか?
抗体によっては、非特異な染色やバックグラウンドが見られることがあり、Stop solutionの添加量を増やすことで改善する場合があります。Stop solutionの添加量は上限30μlを目安にご検討ください。改善されない場合は、直接標識法(1次抗体法)により抗抗原認識能が低下した可能性が考えられます。「直接標識することで免疫染色に影響がみられた抗体種はありますか?」をご参照ください。
保存条件: 冷蔵 , 取扱条件: 吸湿注意 |
この製品に関連する研究では、下記の関連製品も使われています。