FerroOrange

04 細胞内蛍光プローブ

FerroOrange

• 細胞内蛍光プローブ

細胞内鉄イオン測定試薬

• 製品コード
  F374　 FerroOrange
• CAS番号
  –

※ 1 tube当たり24 μgのFerroOrangeが含まれます。

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技術や使用製品に関する補足

【注目の研究・トピック】

Dojin News No.162

地球上の生命体の活動や疾患における鉄の重要性の再認識　(名古屋大学　豊國 伸哉 先生)

Dojin News No.172

二重機能性蛍光色素（H-V）を用いたフェロトーシスの解明

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技術や使用製品に関する補足

ーフェロトーシス研究ー

実験例 : アミノ酸トランスポーター（xCT）阻害　

【関連試薬】

・過酸化脂質検出試薬

(Liperfluo)

・グルタミン酸測定キット

(Glutamate Assay Kit-WST)

・グルタチオン測定キット

(GSSG/GSH Quantification Kit)

Q

FerroOrangeで染色する時の注意点を教えて下さい。

A

染色時は下記の点に注意の上、使用してください。

①FerroOrange染色後の培地交換
培地交換によりFerroOrangeが細胞外へ漏れ出てしまうため、染色後はそのまま観察してください。

②コントロール実験
鉄検出の実験条件を確認するため、鉄キレート試薬Bpy(2,2‘-bipyridine)または鉄（硫酸アンモニウム鉄(II) ）を添加したサンプルを準備し、FerroOrangeの蛍光強度の変化をみられることをお勧めします。

③細胞が染色されにくい（感度が低い）時の対応
細胞種によって染色度合いに差がみられる場合があります。
FerroOrange working solution濃度を推奨の1 μmol/lより高くして染色を行ってください。1-5 μmol/lの範囲での染色をお勧めします。

Q

プレートリーダーでの測定方法を教えてください。

A

下記の実験例を参考に測定ください。

＜測定サンプル＞
サンプルA：添加剤なし（HeLa細胞のみ）
サンプルB：鉄キレート試薬 2,2'-bipyridyl (Bpy) を添加したHeLa細胞
サンプルC：鉄（硫酸アンモニウム鉄）を添加したHeLa細胞

＜測定操作＞
1. 96ウェルマイクロブラックプレート（透明底）にHeLa細胞懸濁液100 μlを 10,000 cells/wellになるよう播種し、37℃インキュベータ（5% CO₂）で一晩培養した。
2. サンプルCの細胞をMEM（FBS不含） 100 μlで3回洗浄した。
3. サンプルCのウェルに硫酸アンモニウム鉄(II)/MEM（FBS不含）溶液 100 μL(終濃度：100 μmol/l)を添加し、37℃インキュベーター（5% CO₂）中で30分間静置した。
4. 全てのウェルの細胞をHBSS 100 μlで3回洗浄した。
5. サンプルAおよびCのウェルに1 μmol/l FerroOrange working solution 100 μlを添加し、サンプルBのウェルにFerroOrange (終濃度：1 μmol/l)及び Bpy (終濃度：100 μmol/l)を含むHBSS溶液 100 μlを添加し、37℃インキュベータ（5% CO₂）で30分間インキュベートした。
6. プレートリーダーにて各サンプルの蛍光強度（Ex: 543 nm、Em: 580 nm）を検出した。

 

＜測定データ＞

Q

推奨のフィルターを教えてください。

A

検出時の推奨フィルターは下記の通りです。
励起フィルター: 530-565 nm
蛍光フィルター: 570-620 nm

Q

フローサイトメーターによる解析は可能ですか？

A

可能です。但し、以下の理由より実験条件の最適化を行う必要があります。

　・細胞密度や細胞の種類によっては、FerroOrangeの染色強度に影響を与える場合があります。
　・培地交換や洗浄により、色素が細胞外に漏れる場合があります。

(参考)
HeLa細胞を用いた実験例をご紹介致します。

＜操作＞
1. MEM（10％ FBS、1％ penicillin-streptomyci）培地に懸濁したHeLa細胞を6ウェルプレートに播種し（1 x10⁵ cells／well）、37℃、5％CO₂インキュベーター中で一晩培養した。
2. 細胞を無血清培地（2 ml）で3回洗浄し、無血清培地（1 ml）を細胞に添加した。
3. 10 mmol/l 硫酸鉄（II）アンモニウム（10 μl）をウェルに添加した（終濃度：100 μmol/l）。
4. 硫酸鉄アンモニウムと無血清培地を混合するため、ウェル内の溶液全量を一度マイクロピペットで吸い上げ、再び同じウェルにゆっくり戻した。
5. 37℃、5％ CO₂インキュベーター中で20分間インキュベートし、HBSS(1 ml)で3回細胞を洗浄した。
6. トリプシン処理（250 µl）後、血清培地（1 ml）で反応を停止し、細胞懸濁液 1.25 mlを遠心管に移した。
7.  細胞懸濁液を1,500 rpm、3分間遠心分離した。
8. 上清を除去し、HBSS（1 ml）を遠心管に加え、ピペッティングにより懸濁した。
9.  細胞懸濁液を1,500 rpmで3分間遠心し、上清を除去した。
10. 無血清培地で希釈した1 μmol/l FerroOrangeを300 μl細胞に添加した。
11. 37℃、5％ CO₂インキュベーター中で15-30分間インキュベートした。
12. 細胞をセルストレーナーに通し、フローサイトメーターを用いて解析した。

 

＜注意点＞

1. 染色後の洗浄によりFerroOrangeが細胞外に漏出するため、染色後洗浄をせずに測定してください。

（染色後の洗浄有無による蛍光強度の差）
  

 

2.  色素溶液の量に依存して蛍光強度が変化することがあるので、等量の色素溶液を添加してください。

　(色素溶液量による蛍光強度の差)
   

3. 鉄(II)を検出する実験条件を確認するために、硫酸鉄(II)アンモニウムを含む試料を調製し、
　　FerroOrangeの蛍光強度の変化を確認することを推奨します。
 

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