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Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST

01 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬

Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST

細胞増殖/細胞毒性測定用試薬
細胞機能解析
細胞毒性

細胞毒性測定キット

優れたコストパフォーマンス
冷蔵で6ヶ月保存可能なWorking Solution
1つのキットで、ホモジニアス測定、ノンホモジニアス測定の選択が可能

製品コード

CK12　 Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST

容　量	メーカー希望小売価格	富士フイルム和光純薬
100 tests	￥11,200	347-91751
500 tests	￥29,700	343-91753
2000 tests	￥44,400	341-91754

<お知らせ>
　取扱説明書を改訂しました。(2022/01/18）

キット内容

100 tests	・Dye Mixture ・Assay Buffer ・lysis Buffer ・Stop Solution	×1 11 ml×1 1.1 ml×1 5.5 ml×1
500 tests	・Dye Mixture ・Assay Buffer ・lysis Buffer ・Stop Solution	×1 55 ml×1 5.5 ml×1 27.5 ml×1
2000 tests	・Dye Mixture ・Assay Buffer ・lysis Buffer ・Stop Solution	×4 55 ml×4 5.5 ml×4 27.5 ml×4

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マニュアル

取扱説明書日本語
Manual English
細胞傷害性試験（ADCC）日本語：Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST を用いた抗体依存性細胞障害測定用
細胞傷害性試験（ADCC）英語 English：Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity Supporting manual

技術情報

測定原理

本キットは、生細胞と反応せず、かつ、細胞にダメージを与えないため、生細胞と死細胞が混在する細胞培養液中に直接試薬を加えても細胞傷害を測定することが可能である（ホモジニアスアッセイ）。なお、一般的に用いられる細胞培養液を取り出してLDH活性を測定する方法も可能である（ノンホモジニアスアッセイ）。また、安定性の高い試薬を用いているため、調製した溶液は長期間保存でき、用時調製する必要がない。そのため、多検体アッセイから、少ない検体数の測定にも対応することができる。

実験例　生細胞測定と死細胞測定の併用した細胞毒性試験

HeLa 細胞にMitomycin C を添加した際の細胞毒性をCell Counting Kit-8とCytotoxicity LDH Assay Kit-WST（本製品）を用いて測定しました。Cell Counting Kit-8による細胞内代謝活性を指標とした方法とCytotoxicity LDH Assay Kit-WSTを用いた細胞膜損傷による遊離LDHを指標とした方法では各々の指標が異なるため、細胞毒性が現れる薬剤濃度に違いがあることが確認されました。

細胞毒性測定キット Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST 同仁化学研究所

試験物質	Mitomycin C
細胞	HeLa
使用培地	MEM, 10% FBS
インキュベート	37℃, 5% CO₂, 48時間
検出波長	Cell Counting Kit-8 (450 nm), Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST (490 nm)

生細胞・死細胞の測定をお得なセットで！　Viability/Cytotoxicity Multiplex Assay Kit
生細胞測定:Cell Counting Kit-8と、死細胞測定:Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST(各500 tests)のお得なセットです。

技術や使用製品に関する補足

細胞増殖/細胞毒性アッセイキット
Cell Counting Kit-8
生細胞・死細胞測定キットセット
Viability/Cytotoxicity Multiplex Assay Kit

抗がん剤ドキソルビシン（DOX）による細胞毒性メカニズム

近年、細胞毒性評価の際に併せて抗酸化能に関与する指標 (NADP⁺/NADPHやGSSG/GSH等)を測定するケースが増えています。
本項目では抗酸化能の低下が細胞毒性発現に関与するDOXの例をご紹介します。

細胞毒性測定キット Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST 同仁化学研究所

技術や使用製品に関する補足

細胞内代謝測定キット

NADP/NADPH Assay Kit-WST
グルタチオン測定キット

GSSG/GSH Quantification Kit
代謝と疾患の関連性を示した報告例

これからはじめる細胞内代謝

参考文献

参考文献を表示する

文献No.	対象サンプル	引用（リンク）
1)	細胞（C3H10T1/2）	S. F. Jin, H. L. Ma, Z. L. Liu, S. T. Fu, C. P Zhang, Y. He, "XL413, a cell division cycle 7 kinase inhibitor enhanced the anti-fibrotic effect of pirfenidone on TGF-β1-stimulated C3H10T1/2 cells via Smad2/4.", Exp Cell Res., 2015, 339, (2), 289.
2)	細胞（HepG2）	S. Watanabe, C. S. Moniaga, S. Nielsen, M. Hara-Chikuma, "Aquaporin-9 facilitates membrane transport of hydrogen peroxide in mammalian cells.", Biochem Biophys Res Commun ., 2016, 471, 191.
3)	細胞（HEECs, Human Esophageal Epithelial Cells）	L. Wu, T. Oshima, J. Shan, H. Sei, T. Tomita, Y. Ohda, H. Fukui, J. Watari, H. Miwa , "PAR-2 activation enhances weak acid-induced ATP release through TRPV1 and ASIC sensitization in human esophageal epithelial cells.", Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol ., 2015, 309, G695.
4)	細胞（Human L02 Hepatocyte)	D. Zhou, B-H Li, J. Wang, Y-N Ding, Y. Dong, Y-W Chen and J-G Fan, "Prolyl Oligopeptidase Inhibition Attenuates Steatosis in the L02 Human Liver Cell Line.", PloS ONE., 2016, 11, (10), e0165224.
5)	細胞（Human primary Hepatocyte)	T. Fukami, A. Iida, K. Konishi, M. Nakajima , "Human arylacetamide deacetylase hydrolyzes ketoconazole to trigger hepatocellular toxicity", Biochem. Pharmacol., 2016, 116, 153.
6)	細胞（Mouse embryonic fibroblast:MEF）	Y. Takanezawa, R. Nakamura, Y. Sone, S. Uraguchi and M. Kiyono, "Atg5-dependent autophagy plays a protective role against methylmercury-induced cytotoxicity", Toxicol. Lett., 2016, 262, 135.
7)	細胞（neural stem/progenitor cells）	M. Tanaka, M. Yoneyama, T. Shiba, T. Yamaguchi, K. Ogita, "Protease-activated receptor-1 negatively regulates proliferation of neural stem/progenitor cells derived from the hippocampal dentate gyrus of the adult mouse ", J Pharmacol Sci., 2016, 131, (3), 162
8)	細胞（Primary cultured cortical neurons）	S. Wakatsuki, A. Furuno, M. Ohshima, and T. Araki, "Oxidative stress-dependent phosphorylation activates ZNRF1 to induce neuronal/axonal degeneration", J Cell Biol., 2015, 211, (4), 881.
9)	細胞（DLD1 and AGS cells）	A. Ishijima, K. Minamihata, S. Yamaguchi, S. Yamahira, R. Ichikawa, E. Kobayashi, M. Iijima, Y. Shibasaki, T. Azuma, T. Nagamune & I. Sakuma, "Selective intracellular vaporisation of antibody-conjugated phase-change nano-droplets in vitro", Scientific Reports ., 2017, DOI:10.1038/srep44077.
10)	細胞（U87, HUVEC cell)	N. Li, W. Zhang, M. Khan, L. Lin, JM. Lin, "MoS2-LA-PEI nanocomposite carrier for real-time imaging of ATP metabolism in glioma stem cells co-cultured with endothelial cells on a microfluidic system", Biosens Bioelectron., 2017, 99, (2018), 142.
11)	組織（マウス肝臓）	Y. Sakurai, W. Mizumura, M. Murata, T. Hada, S. Yamamoto, K. Ito, K. Iwasaki, T. Katoh, Y. Goto, A. Takagi, M. Kohara, H. Suga, and H. Harashima, "Efficient siRNA delivery by lipid nanoparticles modified with a non-standard macrocyclic peptide for EpCAM-targeting", Mol. Pharm.., 2017,10.1021/acs.molpharmaceut.7b00362.
12)	細胞（Human pleural mesothelial cell)	K. Hattori, K. Nakadate, A. Morii, T. Noguchi, Y. Ogasawara, K. Ishii., "Exposure to nano-size titanium dioxide causes oxidative damages in human mesothelial cells: The crystal form rather than size of particle contributes to cytotoxicity.", Biochem. Biophys. Res. Commun.., 2017,10.1016/j.bbrc.2017.08.054.
13)	組織（murine distal colon)	H. Sakai, S. Tabata, M. Kimura, S. Yabe, Y. Isa, Y. Kai, F. Sato, T. Yumoto, K. Miyano, M. Narita and Y. Uezono, "Active Ingredients of Hange-shashin-to, Baicalelin and 6-Gingerol,　Inhibit 5-Fluorouracil-Induced Upregulation of CXCL1 in the Colon to　Attenuate Diarrhea Development", Biol. Pharm.Bull.., 2017, 40, (12), 2134.
14)	細胞（SH-SY5Y cell)	R. Watanabe, T. Kurose, Y. Morishige and K. Fujimori, "Protective Effects of Fisetin Against 6-OHDA-Induced Apoptosis by Activation of PI3K-Akt Signaling in Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cells.", Neurochem. Res.., 2018, 43, (2), 488-499.
15)	細胞 (MC3T3-E1[マウス頭蓋冠由来])	A. Oyane, M. Nakamura, I. Sakamaki, Y. Shimizu, S. Miyata and H. Miyaji, "Laser-assisted wet coating of calcium phosphate for surface-functionalization of PEEK", PLoS ONE ., 2018, doi:10.1371/journal.pone.0206524.
16)	細胞 CRC細胞 [大腸がん]、HT29細胞[ヒト結腸腺癌]	T. Fuji, Y. Umeda, A. Nyuya, F. Taniguchi, T. Kawai, K. Yasui, T. Toshima, K. Yoshida, T. Fujiwara, A. Goel and T.Nagasaka, "Detection of Circulating MicroRNAs with Ago2 Complexes to Monitor the Tumor Dynamics of Colorectal Cancer Patients during Chemotherapy.", Int. J. Cancer., 2018, doi: 10.1002/ijc.31960 .
17)	細胞 (SFXN2ノックアウトHEK293)	E. E. Mon, F. Y. Wei, R. N. R. Ahmad, T. Yamamoto, T. Moroishi and K. Tomizawa, "Regulation of mitochondrial iron homeostasis by siderofexin 2 ", J Physiol Sci., 2018, doi:10.1007/s12576-018-0652-2.
18)	細胞 (Human umbilical vein cell line [EA.Hy926])	Y. Xu, C. Huang, M. Liu, N. Chen, W. Chen, C. Yang, Y. Zhao, X. Li, J. Duan, S. Liu and S. Yang, "Survivin regulated by autophagy mediates hyperglycemia-induced vascular endothelial cell dysfunction", Exp. Cell Res.., 2018, doi: 10.1016/j.yexcr.2018.01.037.
19)	細胞 (MIAPaCa-2[ヒト膵臓がん])	M. Akimoto, R. Maruyama, Y. Kawabata, Y. Tajima and K. Takenaga, "Antidiabetic adiponectin receptor agonist AdipoRon suppresses tumour growth of pancreatic cancer by inducing RIPK1/ERKdependent necroptosis", Cell Death Dis., 2018, 9, 804.
20)	細胞 (Fibro adipogenic progenitor cells:FAPs)	Y. Saito, T. Chikenji, T. Matsumura, M. Nakano and M. Fujimiya, "Exercise enhances skeletal muscle regeneration by promoting senescence in fibro-adipogenic progenitors", Nat. Commun., 2020, doi:10.1038/s41467-020-14734-x.
21)	細胞 (HEK-293EBNA)	M. Suzuki, A. Urabe, S. Sasaki, R. Tsugawa, S. Nishio, H. Mukaiyama, Y. Murata, H. Masuda, M. Aung, A. Mera, M. Takeuchi, K. Fukushima, M. Kanaki, K. Kobayashi, Y. Chiba, B. Shrestha, H. Nakanishi, T. Watanabe, A. Nakayama, H. Fujino, T. Kobayashi, K. Tanino, N. Nishizawa and K. Namba., "Development of a mugineic acid family phytosiderophore analog as an iron fertilizer", Nat. Commun., 2021, doi:10.1038/s41467-021-21837-6.

よくある質問

Q 490 nm以外の吸収フィルターで測定できますか？: A

弊社では490 nmを推奨していますが、490±2-3 nm程度の違いは問題ありません。490 nm以外では、450 nmのフィルターは弊社でも使用実績があり、使用可能です。但し、吸光度値は490 nmと比較し高くなります。

Q 毒性試験でCell Counting Kit-8との相関性はありますか？: A

Cytotoxicity LDH Assay Kit-WSTとCell Counting Kit-8では、測定原理が異なるために必ずしも相関性は得られません。そのため、細胞毒性試験の場合には、遊離LDH測定法とCell Counting Kit-8など数種の指標で測定いただくことをお勧めします。
・Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST：細胞膜の損傷により培地中に漏れ出したLDH活性を測定（細胞膜損傷が指標）
・Cell Counting Kit-8：細胞内の代謝活性（デヒドロゲナーゼ）を測定（代謝活性が指標）

Q LD50値が過去の測定値と大きく異なります。なにか対処法はありますか？: A

・細胞の状態によって、被験物質による影響の受け方が変わりLD50値に影響します。ご使用になる細胞は、継代条件や継代回数をコントロールし、可能な限り同じ状態の細胞をお使い下さい。
・被験物質の希釈系列を調製する際の希釈倍率を狭くすることで、より信頼性の高いLD50値を導き出すことができます。
下記の要領で、使用する被験物質濃度を設定されることをおすすめします。

検討の流れ

① 被検物質が利用できる最高濃度を基準に10倍希釈を繰り返し、5-6桁程度の広い検体濃度域で毒性試験を実施する。[図①]
（①の操作で、毒性が現れる濃度域の予測最高濃度の目安をつける）
② ①の結果から、その被検物質の濃度が現れる濃度の予測最高濃度（100%致死を生じる最低濃度）を基準に2倍希釈を繰り返し、2-3桁をカバーする濃度域で毒性試験をする。[図②]
③ ②の手順を繰り返し、最終的に細胞毒性が20-80%の間に少なくとも検体濃度が3点以上プロットできる濃度域を設定する。[図③]

Q LDHのアイソザイムの測り分けはできますか？: A

本製品は、トータルのLDH活性を指標とした細胞毒性測定用となりますので、LDH1, LDH2, LDH3等の活性の測り分けはできません。

Q サンプルの保存は可能ですか?: A

冷蔵保存では約1週間保存可能です¹⁾。
常温²⁾や冷凍での保存は、LDHが失活するためお薦め致しません。

＜参考文献＞
(1) M. Allen, P. Millett, E. Dawes, N. Rushton., "Lactate dehydrogenase activity as a rapid and sensitive test for the quantification of cell numbers in vitro.", Clin Mater. 1994; 16, (4), 189.
(2) A. Wagner, A. Marc, JM. Engasser, A. Einsele, "The use of lactate dehydrogenase (LDH) release kinetics for the evaluation of death and growth of mammalian cells in perfusion reactors.", Biotechnol Bioeng. 1992; 39, (3), :320..

※安定性は評価条件等により変化する可能性があります。ご理解の上、上記論文をご参考ください。

Q Cytotoxicity LDH Assay Kit-WSTにLDH標準品は入っていますか？: A

細胞毒性試験用のため、LDH標準品は同梱しておりません。LDH活性も測定する場合は、別途、お買い求めください。

Q Stop solution添加後すぐに測定する必要はありますか？: A

Stop solution添加後、3時間以内に測定してください。その場合は、プレートを遮光してください。

Q ウェル間でバラツキが多いのですが何が原因でしょうか？: A

以下の要因が考えられますので、ご確認ください。

①培地の表面に気泡が発生している。

以下の方法で気泡を除去してください。
・シリンジや注射針の先端で、気泡を除去してください。
・（96wellプレート用遠心機をお持ちの場合）1,000 x g, 1分間遠心してください。

②インキュベーション中に培地の水分が蒸発して試薬濃度が変化している。

マイクロプレートの一番外側のウェルは、インキュベーション中の水分蒸発が起こりやすいため、長時間インキュベーションする場合は、一番外側のウェルは測定には利用せず、培地のみを入れて使用してください。

③試薬を添加する際に、最初と最後に添加するウェルの時間差が大きい。

全てのウェルに添加するWorking Solution、Stop Solutionについては、マルチチャンネルピペットのご使用をお勧めします。

④添加した試薬がよく混合されていない。

Lysis Buffer, Working Solution およびStop Solutionを添加した際、プレートミキサーで混合するか、または、プレートの側面を指で軽く叩いて添加した試薬と培地を混和してください。
特に、Lysis Bufferは添加量が少なく、高コントロールの値に影響を与えるため、ご注意ください。
なお、プレートを叩く際は、ウェル中の培地が漏れ出さない程度にしてください。

⑤使用する（マルチチャンネル）ピペットの秤量が正確ではない。

ピペットの秤量が正確か確認してください。

Q バックグラウンドが高くなりました。原因や対策を教えてください。: A

以下の原因が考えられます。
①培地中の血清に含まれるLDHはバックグラウンドを上げます。無血清培地または血清量を5%以下となるように調製した培地をご使用下さい。
②被検物質や培地中に強い還元性を持つ物質が含まれていると、色素WSTが誤発色してバックグラウンドを上げます。試薬ブランクを測定して確認してください。
（なお、一般的なDMEM、RPMI、F-12等の培地には、通常、還元物質は含まれていません）

Q 細胞数最適化時の高コントロールと低コントロールの吸光度の差が小さい: A

①バックグラウンドが高いために低コントロールの吸光度が高くなっている可能性があります。以下を確認してください。

・培地中の血清に含まれるLDHはバックグラウンドを上げます。無血清培地または血清量を5%以下となるように調製した培地をご使用下さい。
・被検物質や培地中に強い還元性を持つ物質が含まれていると、色素WSTが誤発色してバックグラウンドを上げます。試薬ブランクを測定して確認してください。

②高コントロールに生細胞が残っている可能性があります。

Lysis Bufferがウェル内で均一になり細胞が全て死細胞となるように、Lysis Buffer添加後にプレートを軽く振りLysis Bufferが十分に混ざるようにしてください。