日本同仁化学Hampton蛋白结晶试剂盒Micro-Bridges Polypropylene/HR3-340/HR3-342- DOJINDO

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Micro-Bridges Polypropylene

应用

  • Sitting drop crystallization
  • Heavy atom soaks
  • Small molecule crystallization
  • 坐滴结晶
    重原子浸泡
    小分子结晶

特征

  • Perform sitting drop experiments in 24 well hanging drop plates
  • Removable
  • 在 24 孔悬挂滴板中进行坐滴实验
    可拆卸的

描述

Same great Micro-Bridges, but manufactured from clarified polypropylene. These Micro-Bridges are resistant to most organic solvents, and are especially useful with crystallization experiments that involve detergents and other hydrophobic reagents. They resist drop-spreading typically observed when using reagents such as detergents, volatile organics such as iso-propanol and ethanol, and non-volatile organics such as MPD. These Micro-Bridges also resist acetone, dioxane, acetonitrile, 2,2,2-trifluoroethanol, and other aggressive organic solvents.

Approximate dimensions: Height: 12 mm Length: 14 mm Width: 7 mm

同样出色的微型桥接器,但由澄清的聚丙烯制成。 这些微桥对大多数有机溶剂具有耐受性,尤其适用于涉及去污剂和其他疏水性试剂的结晶实验。 当使用诸如去污剂、挥发性有机物(例如异丙醇和乙醇)以及非挥发性有机物(例如 MPD)等试剂时,它们通常会观察到液滴扩散。 这些微桥还可以抵抗丙酮、二恶烷、乙腈、2,2,2-三氟乙醇和其他腐蚀性有机溶剂。

大概尺寸: 高度:12 毫米 长度:14 毫米 宽度:7 毫米

Hampton蛋白结晶试剂盒Micro-Bridges Polypropylene/HR3-340/HR3-342
Hampton蛋白结晶试剂盒Micro-Bridges Polypropylene/HR3-340/HR3-342
Hampton蛋白结晶试剂盒Micro-Bridges Polypropylene/HR3-340/HR3-342
Hampton蛋白结晶试剂盒Micro-Bridges Polypropylene/HR3-340/HR3-342
Hampton蛋白结晶试剂盒Micro-Bridges Polypropylene/HR3-340/HR3-342
Hampton蛋白结晶试剂盒Micro-Bridges Polypropylene/HR3-340/HR3-342

CAT NO

HR3-340

NAME

Micro-Bridges Polypropylene

DESCRIPTION

100 pack

PRICE

$98.00

CAT NO

HR3-342

NAME

Micro-Bridges Polypropylene

DESCRIPTION

400 pack

PRICE

$334.00

支持材料

Hampton蛋白结晶试剂盒Micro-Bridges Polypropylene/HR3-340/HR3-342 Micro-bridges User Guide

日本同仁化学Rhod 2-AM试剂货号:R002 CAS号: 129787-64-0- DOJINDO

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Rhod 2-AM试剂货号:R002
1-[2-Amino-5-(3-dimethylamino-6-dimethylammonio-9-xanthenyl)phenoxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid, tetraacetoxymethyl ester, chloride
CAS号: 129787-64-0
商品信息
储存条件:-20度保存,避光
运输条件:室温
分子式:

C52H59ClN4O19

分子量:

1079.49

特点:

 

● 激发光557nm,发射光581nm

● 红色荧光与罗丹明相似

● 定位准确,信号强度高

宣传资料
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选择规格:
1 mg

现货 

 
钙离子检测方案

Rhod 2-AM试剂货号:R002  CAS号: 129787-64-0

Rhod 2-AM试剂货号:R002  CAS号: 129787-64-0

产品性状
产品概述
原理
激发发射波长
溶解比例
注意事项
参考文献
Q&A

产品性状

规格

性状 :                      本产品为暗紫色固体,使用时将固体溶解于无水DMSO中

纯度(HPLC):          98%以上

 

荧光光谱图  :           符合实验要求

NMR光谱图 :           符合实验要求

处理条件

保存方法 :                避光冷冻

产品概述

在所有的钙离子指示剂中,Rhod 2荧光信号的波长最长。它具有和罗丹明类似的激发和发射波长,分别为557 nm和581 nm。这样的激发波长使得我们很容易就能找到氩和氪光源的激光。尽管有人认为Rhod 2的荧光信号仅仅将钙复合物的荧光增加了数倍,但是Dojindo的Rhod 2由于具有很高的纯度,能有效地将钙荧光信号增加80-100倍左右,使得它的信号强度在所有的钙离子探针里面是最强的。所以,我们强烈建议使用Rhod 2作为探针用激光显微镜来检测细胞内的钙离子情况。有报道称,特别是在神经组织切片培养方面Rhod 2具有定位点的轮廓线更加清晰的特点。Rhod 2和钙离子的解离常数为(Kd=1.0 mM),在所有的钙离子荧光探针中是最高的,为监测钙离子浓度提供了一个广阔的范围。Rhod 2-AM是一种Rhod 2的乙酰甲酯衍生物,能非常容易的通过AM法负载到细胞内。

原理

与其他探针一样,Rhod 2-AM是将四个羧基全部作为脂溶性乙基甲酯体的细胞膜透明性物质。可以很容易地被细胞吸收。通过细胞内的脂肪酶水解成为Rhod 2,可以检测细胞内Ca2+

激发发射波长

E x :557 nm

Em: 581 nm

溶解比例

溶解比例:1mg/ml(DMSO),50mg/ml(三氯甲烷)

注意事项

1、试剂容易吸潮,从冰箱取出后,请确认在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂极其微量,

开封前,请轻弹管壁几次,以保证粉末落入管底。

2、第一次使用时, 建议母液即配即用。试剂溶解后尽可能在短时间内使用,以保证实验效果。

3、溶解液 DMSO 需要保证新鲜无水,否则将会导致 AM 体水解,荧光染料无法进入细胞影响实验效果。

4、母液遇水极易分解,如果不能一次用完,建议分装保存,例如分装成 5 μl/管,用封口膜封口,

并用铝箔纸包裹,放在一个密闭性能好的塑料袋中,并放入一包干燥剂,在≤-20℃密封避光保存。

5、建议您在正式实验前先摸索一下细胞量、钙离子荧光探针的终浓度、培养时间等,找到最佳实验条件

参考文献

1) R. Y. Tsien, “New Calcium Indicators and Buffers with High Selectivity against Magnesium and Protons: Design, Synthesis, and Properties of Prototype Structures”, Biochemistry, 1980, 19 (11), 2396.

2) R. Y. Tsien, T. Pozzan and T. J. Rink, “Calcium Homeostasis in Intact Lymphocytes: Cytoplasmic Free Calcium Monitored with a New, Intracellularly Trapped Fluorescent Indicator”, J. Cell Biol., 1982, 94, 325.

3) M. B. Feinstein, J. J. Egan, R. I. Sha’afi and J. White, “The Cytoplasmic Concentration of Free Calcium Inplatelets Is Controlled by Stimulators of Cyclic AMP Production (PGD2, PGE1, FORSKOLIN)”, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1983, 113, 598.

4) N. Miyoshi, K. Hara, S. Kimura, K. Nakanishi and M. Fukuda, “A New Method of Determining Intracellular Free Ca2+ Concentration Using Quin 2-fluorescence”, Photochem. Photobiol., 1991, 53 (3), 415.

5)Hao Gu, Yuhui Zhu, Jiawei Yang, Ruixue Jiang, Yuwei Deng, Anshuo Li, Yingjing Fang, Qianju Wu, Honghuan Tu, Haishuang Chang, Jin Wen, Xinquan Jiang,”Liver-Inspired Polyetherketoneketone Scaffolds Simulate Regenerative Signals and Mobilize Anti-Inflammatory Reserves to Reprogram Macrophage Metabolism for Boosted Osteoporotic Osseointegration.Advanced Science”,2023, Advanced Science, doi:10.1002/advs.202302136

Q&A

 

 

 

Q1: 细胞内检测钙离子的试剂种类都有什么,选择什么样的比较好呢?

 

 

A1: 根据检测仪器和检测波长有很多的选择,产品后面标有AM的试剂是可以通过细胞膜的

有很多种相似的试剂,其特点如下:

【Fura 2】

•双波长激发

激发(λex= Ca:340 nm, Ca free:380 nm)、发射:λem=500 nm

•解离常数:224 nmol/L

•因为是荧光强度的比值、可以有效的减小误差

=>細胞内Ca浓度计算。

•该试剂被使用的最多

•必须要更换过滤片、会耽误一些时间。

【Fluo 3】

•单波长激发

激发:λex=508 nm、发射:λem=527 nm

•解离常数:400 nmol/L

•因为激发光在长波段,所以对细胞的损伤比较小

(不会受到NADH、NADPH的影响)

•可以使用Ar激光激发装置。

•不适合切片中钙离子的检测

•【Fluo 4】

•单波长激发

•激发:λex=495 nm、发射:λem=518 nm

•解离常数:360 nmol/L

•与Fluo3相比对荧光强度更高。

•因为激发光在长波段,所以对细胞的损伤比较小

•(不会受到NADH、NADPH的影响)

•可以使用Ar激光激发装置。 •与Fluo3相比对細胞的毒性低

•【Indo 1】

•单波长激发

•激发:λex= 330 nm、发射(λem= Ca:410 nm, Ca free:485 nm)

•解离常数:250 nmol/L

•由于不需要更换滤光片,可以很快地检测细胞内钙离子浓度变化以及像心肌细胞运动中钙离子的变化

•(需要两台检测仪器)

•【Rhod 2】

•单波长激发

•激发:λex=553 nm、发射:λem=576 nm

•解离常数:1.0 μmol/L

•因为激发光在长波段,所以对细胞的损伤比较小

•(不会受到NADH、NADPH的影响)

•可以使用Ar激光激发装置。

•【Quin 2】

•单波长激发

•激发:λex=339 nm、发射:λem=492 nm

•解离常数:110 nmol/L

•最早开发的产品

日本同仁化学Fluo 4-AM试剂货号:F311 CAS号:273221-67-3- DOJINDO

上海金畔生物科技有限公司代理日本同仁化学 DOJINDO代理商全线产品,欢迎访问官网了解更多信息

Fluo 4-AM试剂货号:F311
1-[2-Amino-5-(2,7-difluoro-6-acetoxymethoxy-3-oxo-9-xanthenyl)phenoxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid, tetra(acetoxymethyl)ester
CAS号:273221-67-3
商品信息
储存条件:-20度保存,避光
运输条件:室温
分子式:

C51H50F2N2O23

分子量:

1096.94

特点:

 

● 激发波长494 nm,发射波长516 nm

● 激光共聚焦,流式细胞仪均可检测

● 荧光强度高

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选择规格:
1mg

现货 

 
钙离子

产品性状
产品概述
原理
激发发射波长
操作步骤
注意事项
数据处理
文献
Q&A

产品性状

规格

性状 :                      本产品为橙红色粉末,使用时将固体溶解于无水DMSO中

纯度(HPLC):          98%以上

 

荧光光谱图:             符合实验要求

NMR光谱图:            符合实验要求

处理条件

保存方法 :                避光冷冻

产品概述

Fluo 4是一种将Fluo 3结构中的Cl替换成F的钙荧光探针。由于将Cl替换成了电子吸引力更强的F,它的最大激发波长会向短波长处偏离10 nm左右。这个波长更接近于氩激光器的波长,所以用氩激光器激发时,Fluo 4的荧光强度比Fluo 3强1倍。

原理

Fluo 4-AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料,需用无水DMSO配制。Fluo 4-AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo 4,从而被滞留在细胞内。产生的Fluo 4随后会和钙离子(Ca2+)结合并发出荧光。由于Fluo 4与钙离子的亲和力和Fluo 3近似(Fluo 3:Kd=0.4 μmol/l、Fluo 4: Kd=0.36 μmol/l),所以使用上和Fluo 3也基本相同,可以使用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪等仪器检测细胞内钙离子浓度的变化。钙离子探针种类繁多,根据不同的实验要求,选择不同的产品。

激发发射波长

E x   :494 nm

E m :516 nm

操作步骤

1、用 HBSS 溶液稀释 1-5 mmol/l 的 Fluo 4-AM 母液,配制成 1-5 µmol/l 的 Fluo 4-AM 工作液。

(此浓度仅供参考,请根据具体实验要求自行调整)

例如:1 mmol/l 母液配制 1 ml 浓度为 5 µmol/l 工作液的方法:用 1 ml HBSS 溶液稀释 5 µl 母

液即可。Fluo 4-AM 工作液需要即配即用,请勿反复冻存。如果Fluo 4-AM进入细胞的效果不好,可

使用Pluronic® F-127,后者可以防止Fluo 4-AM在缓冲液里聚合并能促进其进入细胞。

*Pluronic® F-127 先用DMSO溶解至浓度为 20%(W/V),然后根据实验需要直接加入Fluo 4-AM工作

液中至终浓度为 0.04-0.05%(此浓度仅供参考,请根据具体实验要求自行调整)。

2、取出预培养的细胞,除去培养基,使用 HBSS 溶液洗涤细胞 3 次。如果使用含血清的培养基,血清中

的酯酶会分解 AM 体,从而降低 Fluo 4-AM 进入细胞的效果。另外含有酚红的培养基会使本底值略

微偏高,所以加工作液之前需尽量去除培养基残留。

3、加入 Fluo 4-AM 工作液,溶液量以覆盖细胞为准。

4、37℃细胞培养箱孵育 10-60 分钟,除去 Fluo 4-AM 工作液。关于孵育的时间,如果首次做实验不能

确定,建议先孵育 30 分钟,看荧光效果:如果细胞死亡较多,适当缩短时间;如果荧光强度太

弱,适当延长时间。

5、用 HBSS溶液洗涤细胞 3 次,以充分去除残留的 Fluo 4-AM 工作液。然后加入 HBSS 溶液覆盖细胞。

6、37℃培养箱孵育约 20-30 分钟,以确保 AM 体在细胞内的完全去酯化作用。

如果细胞内酯酶活性较低,建议严格按照此操作进行;酯酶活性高的细胞实验,可以忽略此步。

7、用激光共聚焦或荧光显微镜检测细胞,激发波长 494 nm,发射波长 516 nm。

注意事项

1、试剂容易吸潮,从冰箱取出后,请确认在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂极其微量,

开封前,请轻弹管壁几次,以保证粉末落入管底。

2、第一次使用时, 建议母液即配即用。试剂溶解后尽可能在短时间内使用,以保证实验效果。

3、溶解液DMSO需要保证新鲜无水,否则将会导致 AM 体水解,使荧光染料无法进入细胞,影响实验效果

4、母液遇水极易分解,如果不能一次用完,建议分装保存,例如分装成 5 μl/管,用封口膜封口,

并用铝箔纸包裹,放在一个密闭性能好的塑料袋中,并放入一包干燥剂,在≤-20℃密封避光保存。

5、建议您在正式实验前先摸索一下细胞量、钙离子荧光探针的终浓度、培养时间等,找到最佳实验条件

数据处理

计算公式:

[Ca2+]i = Kd×(F-Fmin) / (Fmax-F)

[Ca2+]i :细胞内Ca2+浓度

Kd:解离常数

F  :荧光强度

Fmin:Ca2+为零状态下测得的荧光比值

Fmax:Ca2+为饱和状态下测得的荧光比值

文献

1) A. Minta, J. P. Y. Kao and R. Y. Tsien, “Fluorescent Indicators for Cytosolic Calcium Based on Rhodamine and Fluorescein Chromophores”, J. Biol. Chem., 1989, 264(14), 8171.

2) J. P. Kao, A. T. Harootunian and R. Y. Tsien, “Photochemically Generated Cytosolic Calcium Pulses and Their Detection by Fluo-3”, J. Biol. Chem., 1989, 264, 8179.

3) M. Eberhard and P. Erne, “Kinetics of Calcium Binding to Fluo-3 by Stopped-Flow Fluorescence”, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1989, 163, 309.

4) A. Hernandez-Cruz, F. Sala and P. R. Adams, “Subcellular Calcium Transients Visualized by Confocal Microscopy in a Voltage-clamped Vertebrate Neuron”, Science, 1990, 247, 858.

5) A. H. Cornell-Bell, S. M. Finkbeiner, M. S. Cooper and S. J. Smith, “Glutamate Induces Calcium Waves in Cultured Astrocytes: Long-Range Glial Signaling”, Science, 1990, 247, 470.

6) D. A. Williams, “Quantitative Intracellular Calcium Imaging with Laser-scanning Confocal Microscopy”, Cell Calcium, 1990, 11, 589.

7) D. A. Williams, S. H. Cody, C. A. Gehring, R. W. Parish and P. J. Harris, “Confocal Imaging of Ionised Calcium in Living Plant Cells”, Cell Calcium, 1990, 11, 291.

8) P. A. Vandenberghe and J. L. Ceuppens, “Flow Cytometric Measurement of Cytoplasmic Free Calcium in Human Peripheral Blood T Lymphocytes with Fluo-3, A New Fluorescent Calcium Indicator”, J. Immunol. Methods, 1990, 127, 197.

10) M. Iino, H. Kasai and T. Yamazawa, “Visualization of Neural Control of Intracellular Ca2+ Concentration in Single Vascular Smooth Muscle Cells in situ”, EMBO J., 1994, 13 (21), 5026.

11) M. E. Dailey and S. J. Smith, “Spontaneous Ca2+ Transients in Developing Hippocampal Pyramidal Cells”, J. Neurobiol., 1994, 25(3), 243.

12) M. Burnier, G. Centeno, E. Burki and H. R. Brunner, “Confocal Microscopy to Analyze Cytosolic and Nuclear Calcium in Cultured Vascular Cells”, Am. J. Physiol., 1994, 266, C1118.

13) E. Donnadieu and L. Y. W. Bourguignon, “Ca2+ Signaling in Endothelial Cells Stimulated by Bradykinin: Ca2+ Measurement in the Mitochondria and the Cytosol by Confocal Microscopy”, Cell Calcium, 1996, 20 (1), 53.

14) M. Ikeda, H. Ariyoshi, J. Kambayashi, K. Fujitani, N. Shinoki, M. Sakon, T. Kawasaki and M. Monden, “Separate Analysis of Nuclear and Cytosolic Ca2+ Concentrations in Human Umbilical Vein Endothelial Cells”, J. Cell. Biochem., 1996, 63 (1), 23.

15) J. E. Merritt, S. A. McCarthy, M. P. A. Davies and K. E. Moores, “Use of fluo-3 to Measure Cytosolic Ca2+ in Platelets and Neutrophils Loading Cells with the Dye, Calibration of Traces, Measurements in the Presence of Plasma, and Buffering of Cytosolic Ca2+”, Biochem. J., 1990, 269, 513.

Q&A

 

 

 

Q1: 细胞内检测钙离子的试剂种类都有什么,选择什么样的比较好呢?

 

 

A1: 根据检测仪器和检测波长有很多的选择,产品后面标有AM的试剂是可以通过细胞膜的

有很多种相似的试剂,其特点如下:

【Fura 2】

•双波长激发

激发(λex= Ca:340 nm, Ca free:380 nm)、发射:λem=500 nm

•解离常数:224 nmol/L

•因为是荧光强度的比值、可以有效的减小误差

=>細胞内Ca浓度计算。

•该试剂被使用的最多

•必须要更换过滤片、会耽误一些时间。

【Fluo 3】

•单波长激发

激发:λex=508 nm、发射:λem=527 nm

•解离常数:400 nmol/L

•因为激发光在长波段,所以对细胞的损伤比较小

(不会受到NADH、NADPH的影响)

•可以使用Ar激光激发装置。

•不适合切片中钙离子的检测

•【Fluo 4】

•单波长激发

•激发:λex=495 nm、发射:λem=518 nm

•解离常数:360 nmol/L

•与Fluo3相比对荧光强度更高。

•因为激发光在长波段,所以对细胞的损伤比较小

•(不会受到NADH、NADPH的影响)

•可以使用Ar激光激发装置。 •与Fluo3相比对細胞的毒性低

•【Indo 1】

•单波长激发

•激发:λex= 330 nm、发射(λem= Ca:410 nm, Ca free:485 nm)

•解离常数:250 nmol/L

•由于不需要更换滤光片,可以很快地检测细胞内钙离子浓度变化以及像心肌细胞运动中钙离子的变化

•(需要两台检测仪器)

•【Rhod 2】

•单波长激发

•激发:λex=553 nm、发射:λem=576 nm

•解离常数:1.0 μmol/L

•因为激发光在长波段,所以对细胞的损伤比较小

•(不会受到NADH、NADPH的影响)

•可以使用Ar激光激发装置。

•【Quin 2】

•单波长激发

•激发:λex=339 nm、发射:λem=492 nm

•解离常数:110 nmol/L

•最早开发的产品

日本同仁化学Fluo 4-AM special packaging试剂货号:F312 CAS号:273221-67-3- DOJINDO

上海金畔生物科技有限公司代理日本同仁化学 DOJINDO代理商全线产品,欢迎访问官网了解更多信息

Fluo 4-AM special packaging试剂货号:F312
1-[2-Amino-5-(2,7-difluoro-6-acetoxymethoxy-3-oxo-9-xanthenyl)phenoxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid, tetra(acetoxymethyl)ester
CAS号:273221-67-3
商品信息
储存条件:-20度保存,避光
运输条件:室温
分子式:

C51H50F2N2O23

分子量:

1096.94

特点:

 

● 激发波长494 nm,发射波长516 nm

● 激光共聚焦,流式细胞仪均可检测

● 荧光强度高

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选择规格:
50ug
50ug*8

现货

 
钙离子

Fluo 4-AM special packaging试剂货号:F312 CAS号:273221-67-3

Fluo 4-AM special packaging试剂货号:F312 CAS号:273221-67-3

活动进行中
产品性状
产品概述
原理
激发发射波长
操作步骤
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荧光光谱图  :            符合实验要求

NMR光谱图 :           符合实验要求

处理条件

保存方法 :                避光冷冻

产品概述

Fluo 4是一种将Fluo 3结构中的Cl替换成F的钙荧光探针。由于将Cl替换成了电子吸引力更强的F,它的最大激发波长会向短波长处偏离10 nm左右。这个波长更接近于氩激光器的波长,所以用氩激光器激发时,Fluo 4的荧光强度比Fluo 3强1倍。

原理

Fluo 4-AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料,需用无水DMSO配制。Fluo 4-AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo 4,从而被滞留在细胞内。产生的Fluo 4随后会和钙离子(Ca2+)结合并发出荧光。由于Fluo 4与钙离子的亲和力和Fluo 3近似(Fluo 3:Kd=0.4 μmol/l、Fluo 4: Kd=0.36 μmol/l),所以使用上和Fluo 3也基本相同,可以使用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪等仪器检测细胞内钙离子浓度的变化。钙离子探针种类繁多,根据不同的实验要求,选择不同的产品。

激发发射波长

E x   :494 nm

E m  :516 nm

操作步骤

1、用 HBSS 溶液稀释 1-5 mmol/l 的 Fluo 4-AM 母液,配制成 1-5 µmol/l 的 Fluo 4-AM 工作液。

(此浓度仅供参考,请根据具体实验要求自行调整)

例如:1 mmol/l 母液配制 1 ml 浓度为 5 µmol/l 工作液的方法:用 1 ml HBSS 溶液稀释 5 µl 母

液即可。Fluo 4-AM 工作液需要即配即用,请勿反复冻存。如果Fluo 4-AM进入细胞的效果不好,可

使用Pluronic® F-127,后者可以防止Fluo 4-AM在缓冲液里聚合并能促进其进入细胞。

*Pluronic® F-127 先用DMSO溶解至浓度为 20%(W/V),然后根据实验需要直接加入Fluo 4-AM工作

液中至终浓度为 0.04-0.05%(此浓度仅供参考,请根据具体实验要求自行调整)。

2、取出预培养的细胞,除去培养基,使用 HBSS 溶液洗涤细胞 3 次。如果使用含血清的培养基,血清中

的酯酶会分解 AM 体,从而降低 Fluo 4-AM 进入细胞的效果。另外含有酚红的培养基会使本底值略

微偏高,所以加工作液之前需尽量去除培养基残留。

3、加入 Fluo 4-AM 工作液,溶液量以覆盖细胞为准。

4、37℃细胞培养箱孵育 10-60 分钟,除去 Fluo 4-AM 工作液。关于孵育的时间,如果首次做实验不能

确定,建议先孵育30分钟看荧光效果:如果细胞死亡较多,适当缩短时间;如果荧光强度太弱,

适当延长时间。

5、用 HBSS溶液洗涤细胞 3 次,以充分去除残留的 Fluo 4-AM 工作液。然后加入 HBSS 溶液覆盖细胞。

6、37℃培养箱孵育约 20-30 分钟,以确保 AM 体在细胞内的完全去酯化作用。

如果细胞内酯酶活性较低,建议严格按照此操作进行;酯酶活性高的细胞实验,可以忽略此步。

7、用激光共聚焦或荧光显微镜检测细胞,激发波长 494 nm,发射波长 516 nm。

注意事项

1、试剂容易吸潮,从冰箱取出后,请确认在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂极其微量,

开封前,请轻弹管壁几次,以保证粉末落入管底。

2、第一次使用时, 建议母液即配即用。试剂溶解后尽可能在短时间内使用,以保证实验效果。

3、溶解液DMSO需要保证新鲜无水,否则将会导致 AM 体水解,使荧光染料无法进入细胞,影响实验效果

4、母液遇水极易分解,如果不能一次用完,建议分装保存,例如分装成 5 μl/管,用封口膜封口,

并用铝箔纸包裹,放在一个密闭性能好的塑料袋中,并放入一包干燥剂,在≤-20℃密封避光保存。

5、建议您在正式实验前先摸索一下细胞量、钙离子荧光探针的终浓度、培养时间等,找到最佳实验条件

数据处理

计算公式:

[Ca2+]i = Kd×(F-Fmin) / (Fmax-F)

[Ca2+]i :细胞内Ca2+浓度

Kd:解离常数

F  :荧光强度

Fmin:Ca2+为零状态下测得的荧光比值

Fmax:Ca2+为饱和状态下测得的荧光比值

文献

1) A. Minta, J. P. Y. Kao and R. Y. Tsien, “Fluorescent Indicators for Cytosolic Calcium Based on Rhodamine and Fluorescein Chromophores”, J. Biol. Chem., 1989, 264(14), 8171.

2) J. P. Kao, A. T. Harootunian and R. Y. Tsien, “Photochemically Generated Cytosolic Calcium Pulses and Their Detection by Fluo-3”, J. Biol. Chem., 1989, 264, 8179.

3) M. Eberhard and P. Erne, “Kinetics of Calcium Binding to Fluo-3 by Stopped-Flow Fluorescence”, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1989, 163, 309.

4) A. Hernandez-Cruz, F. Sala and P. R. Adams, “Subcellular Calcium Transients Visualized by Confocal Microscopy in a Voltage-clamped Vertebrate Neuron”, Science, 1990, 247, 858.

5) A. H. Cornell-Bell, S. M. Finkbeiner, M. S. Cooper and S. J. Smith, “Glutamate Induces Calcium Waves in Cultured Astrocytes: Long-Range Glial Signaling”, Science, 1990, 247, 470.

6) D. A. Williams, “Quantitative Intracellular Calcium Imaging with Laser-scanning Confocal Microscopy”, Cell Calcium, 1990, 11, 589.

7) D. A. Williams, S. H. Cody, C. A. Gehring, R. W. Parish and P. J. Harris, “Confocal Imaging of Ionised Calcium in Living Plant Cells”, Cell Calcium, 1990, 11, 291.

8) P. A. Vandenberghe and J. L. Ceuppens, “Flow Cytometric Measurement of Cytoplasmic Free Calcium in Human Peripheral Blood T Lymphocytes with Fluo-3, A New Fluorescent Calcium Indicator”, J. Immunol. Methods, 1990, 127, 197.

10) M. Iino, H. Kasai and T. Yamazawa, “Visualization of Neural Control of Intracellular Ca2+ Concentration in Single Vascular Smooth Muscle Cells in situ”, EMBO J., 1994, 13 (21), 5026.

11) M. E. Dailey and S. J. Smith, “Spontaneous Ca2+ Transients in Developing Hippocampal Pyramidal Cells”, J. Neurobiol., 1994, 25(3), 243.

12) M. Burnier, G. Centeno, E. Burki and H. R. Brunner, “Confocal Microscopy to Analyze Cytosolic and Nuclear Calcium in Cultured Vascular Cells”, Am. J. Physiol., 1994, 266, C1118.

13) E. Donnadieu and L. Y. W. Bourguignon, “Ca2+ Signaling in Endothelial Cells Stimulated by Bradykinin: Ca2+ Measurement in the Mitochondria and the Cytosol by Confocal Microscopy”, Cell Calcium, 1996, 20 (1), 53.

14) M. Ikeda, H. Ariyoshi, J. Kambayashi, K. Fujitani, N. Shinoki, M. Sakon, T. Kawasaki and M. Monden, “Separate Analysis of Nuclear and Cytosolic Ca2+ Concentrations in Human Umbilical Vein Endothelial Cells”, J. Cell. Biochem., 1996, 63 (1), 23.

15) J. E. Merritt, S. A. McCarthy, M. P. A. Davies and K. E. Moores, “Use of fluo-3 to Measure Cytosolic Ca2+ in Platelets and Neutrophils Loading Cells with the Dye, Calibration of Traces, Measurements in the Presence of Plasma, and Buffering of Cytosolic Ca2+”, Biochem. J., 1990, 269, 513.

16)Hao Gu, Yuhui Zhu, Jiawei Yang, Ruixue Jiang, Yuwei Deng, Anshuo Li, Yingjing Fang, Qianju Wu, Honghuan Tu, Haishuang Chang, Jin Wen, Xinquan Jiang,”Liver-Inspired Polyetherketoneketone Scaffolds Simulate Regenerative Signals and Mobilize Anti-Inflammatory Reserves to Reprogram Macrophage Metabolism for Boosted Osteoporotic Osseointegration.Advanced Science”,2023, Advanced Science, doi:10.1002/advs.202302136

Q&A

 

 

 

Q1: 细胞内检测钙离子的试剂种类都有什么,选择什么样的比较好呢?

 

 

A1: 根据检测仪器和检测波长有很多的选择,产品后面标有AM的试剂是可以通过细胞膜的

有很多种相似的试剂,其特点如下:

【Fura 2】

•双波长激发

激发(λex= Ca:340 nm, Ca free:380 nm)、发射:λem=500 nm

•解离常数:224 nmol/L

•因为是荧光强度的比值、可以有效的减小误差

=>細胞内Ca浓度计算。

•该试剂被使用的最多

•必须要更换过滤片、会耽误一些时间。

【Fluo 3】

•单波长激发

激发:λex=508 nm、发射:λem=527 nm

•解离常数:400 nmol/L

•因为激发光在长波段,所以对细胞的损伤比较小

(不会受到NADH、NADPH的影响)

•可以使用Ar激光激发装置。

•不适合切片中钙离子的检测

•【Fluo 4】

•单波长激发

•激发:λex=495 nm、发射:λem=518 nm

•解离常数:360 nmol/L

•与Fluo3相比对荧光强度更高。

•因为激发光在长波段,所以对细胞的损伤比较小

•(不会受到NADH、NADPH的影响)

•可以使用Ar激光激发装置。 •与Fluo3相比对細胞的毒性低

•【Indo 1】

•单波长激发

•激发:λex= 330 nm、发射(λem= Ca:410 nm, Ca free:485 nm)

•解离常数:250 nmol/L

•由于不需要更换滤光片,可以很快地检测细胞内钙离子浓度变化以及像心肌细胞运动中钙离子的变化

•(需要两台检测仪器)

•【Rhod 2】

•单波长激发

•激发:λex=553 nm、发射:λem=576 nm

•解离常数:1.0 μmol/L

•因为激发光在长波段,所以对细胞的损伤比较小

•(不会受到NADH、NADPH的影响)

•可以使用Ar激光激发装置。

•【Quin 2】

•单波长激发

•激发:λex=339 nm、发射:λem=492 nm

•解离常数:110 nmol/L

•最早开发的产品

日本同仁化学Fluo 3-AM试剂货号:F023 CAS号:121714-22-5- DOJINDO

上海金畔生物科技有限公司代理日本同仁化学 DOJINDO代理商全线产品,欢迎访问官网了解更多信息

Fluo 3-AM试剂货号:F023
1-[2-Amino-5-(2,7-dichloro-6-acetoxymethoxy-3-oxo-9-xanthenyl)phenoxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid, tetra(acetoxymethyl)ester
CAS号:121714-22-5
商品信息
储存条件:-20度保存,避光
运输条件:室温
分子式:

C51H50Cl2N2O23

分子量:

1129.85

特点:

 

● 激发波长480-500 nm,发射波长523-530 nm

● 激光共聚焦,流式细胞仪均可检测

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宣传资料
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选择规格:
1mg

现货 

 
钙离子

Fluo 3-AM试剂货号:F023 CAS号:121714-22-5

Fluo 3-AM试剂货号:F023 CAS号:121714-22-5

产品性状
产品概述
原理
激发发射波长
操作步骤
注意事项
实验例
数据分析
Q&A

产品性状

规格

性状 :                      本产品为红色粉末,使用时将固体溶解于无水DMSO中

纯度(HPLC):          98%以上

 

荧光光谱图:             符合实验要求

NMR光谱图:            符合实验要求

处理条件

保存方法 :                避光冷冻

产品概述

Fluo 3-AM是一种检测细胞内钙离子的荧光探针。Fluo 3若以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的,但是当它与钙离子Ca2+结合后荧光会增加60至80倍,是目前最常用的一种钙离子荧光探针。激光共聚焦荧光显微镜具有氩激光器,所以Fluo 3可被广泛使用于这种显微镜上。这种荧光信号发出来的长波也便于减小对样品细胞的光损伤。Fluo 3也可用来检测紫外光照射下可裂解的螯合钙或其它形式的钙。Fluo 3-AM是Fluo 3的一种乙酰甲酯衍生物,通过培养,能够轻易进入细胞中。

原理

Fluo 3-AM (钙离子荧光探针) 需用无水DMSO (anhydrous DMSO)配制。Fluo 3-AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo 3-AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo 3,从而被滞留在细胞内。Fluo 3可以和钙离子结合,结合钙离子后可以产生较强的荧光,最大激发波长为506nm,最大发射波长为526nm

激发发射波长

E x :480-500 nm

E m :525-530 nm

操作步骤

1、用 HBSS 溶液稀释 1-5 mmol/l 的 Fluo 3-AM 母液,配制成 1-5 µmol/l的 Fluo 3-AM 工作液

(此浓度仅供参考,请根据具体实验要求自行调整)。

例如:1 mmol/l 母液配制 1 ml 浓度为 5 µmol/l工作液的方法:用 1 ml HBSS 溶液稀释 5 µl母液

即可。Fluo 3-AM 工作液需要即配即用,请勿反复冻存。如果Fluo 3-AM进入细胞的效果不好,

可使用Pluronic® F-127,后者可以防止Fluo 3-AM在缓冲液里聚合并能促进其进入细胞。

*Pluronic® F-127先用DMSO溶解至浓度为 20%(W/V),然后根据实验需要直接加入Fluo 3-AM工作液

中至终浓度为 0.04-0.05%(此浓度仅供参考,请根据具体实验要求自行调整)。

2、取出预培养的细胞,除去培养基,用 HBSS 溶液洗涤细胞 3 次。

如果使用含血清的培养基,血清中的酯酶会分解 AM 体,从而降低 Fluo 3-AM 进入细胞的效果。

另外含有酚红的培养基会使本底值略微偏高,所以加工作液之前需尽量去除培养基残留。

3、加入 Fluo 3-AM 工作液,溶液量以覆盖细胞为准。

4、37℃细胞培养箱孵育10-60分钟,除去Fluo 3-AM工作液。关于孵育的时间,如果首次做实验不能定,

建议先孵育 30 分钟,看荧光效果:如果细胞死亡较多,适当缩短时间;如果荧光强度太弱,

适当延长时间。

5、用 HBSS 溶液洗涤细胞 3 次以充分去除残留的 Fluo 3-AM 工作液。然后加入 HBSS 溶液覆盖细胞。

6、37℃培养箱孵育约 20-30 分钟,以确保 AM 体在细胞内的完全去酯化作用。

如果细胞内酯酶活性较低,建议严格按照此操作进行;酯酶活性高的细胞实验,可以忽略此步。

7、用激光共聚焦或荧光显微镜检测细胞,激发波长 480-500 nm,发射波长 525-530 nm。

注意事项

1、试剂容易吸潮,从冰箱取出后,请确认在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂极其微量,

开封前,请轻弹管壁几次,以保证粉末落入管底。

2、第一次使用时, 建议母液即配即用。试剂溶解后尽可能在短时间内使用,以保证实验效果。

3、溶解液DMSO需要保证新鲜无水,否则将会导致AM体水解,使荧光染料无法进入细胞,影响实验效果。

4、母液遇水极易分解,如果不能一次用完,建议分装保存,例如分装成5 μl/管,用封口膜封口,并用

铝箔纸包裹,放在一个密闭性能好的塑料袋中,并放入一包干燥剂,在≤-20℃密封避光保存。

5、建议您在正式实验前先摸索一下细胞量、钙离子荧光探针终浓度、培养时间等,找到最佳实验条件。

实验例

加载了Fluo 3的新鲜分离的大鼠肝脏细胞PE刺激后出现规则胞浆钙振荡。

上图为细胞明场图和不同时间点(min)的比例成像,

下图为影响Fluo 3荧光强度随时间的变化。

成像系统:Photon Technology International Inc.,

显微镜Nikon TE2000U,CCD相机QuantEM512S,软件ERP。

(北京师范大学细胞生物学研究所 崔宗杰教授 提供照片)

 

数据分析

计算公式:

[Ca2+]i = Kd×(F-Fmin) / (Fmax-F)

[Ca2+]i :细胞内Ca2+浓度

Kd:解离常数

F :荧光强度

Fmin:Ca2+为零状态下测得的荧光比值

Fmax:Ca2+为饱和状态下测得的荧光比值

Q&A

 

 

 

Q1: 细胞内检测钙离子的试剂种类都有什么,选择什么样的比较好呢?

 

 

A1: 根据检测仪器和检测波长有很多的选择,产品后面标有AM的试剂是可以通过细胞膜的

有很多种相似的试剂,其特点如下:

【Fura 2】

•双波长激发

激发(λex= Ca:340 nm, Ca free:380 nm)、发射:λem=500 nm

•解离常数:224 nmol/L

•因为是荧光强度的比值、可以有效的减小误差

=>細胞内Ca浓度计算。

•该试剂被使用的最多

•必须要更换过滤片、会耽误一些时间。

【Fluo 3】

•单波长激发

激发:λex=508 nm、发射:λem=527 nm

•解离常数:400 nmol/L

•因为激发光在长波段,所以对细胞的损伤比较小

(不会受到NADH、NADPH的影响)

•可以使用Ar激光激发装置。

•不适合切片中钙离子的检测

•【Fluo 4】

•单波长激发

•激发:λex=495 nm、发射:λem=518 nm

•解离常数:360 nmol/L

•与Fluo3相比对荧光强度更高。

•因为激发光在长波段,所以对细胞的损伤比较小

•(不会受到NADH、NADPH的影响)

•可以使用Ar激光激发装置。 •与Fluo3相比对細胞的毒性低

•【Indo 1】

•单波长激发

•激发:λex= 330 nm、发射(λem= Ca:410 nm, Ca free:485 nm)

•解离常数:250 nmol/L

•由于不需要更换滤光片,可以很快地检测细胞内钙离子浓度变化以及像心肌细胞运动中钙离子的变化

•(需要两台检测仪器)

•【Rhod 2】

•单波长激发

•激发:λex=553 nm、发射:λem=576 nm

•解离常数:1.0 μmol/L

•因为激发光在长波段,所以对细胞的损伤比较小

•(不会受到NADH、NADPH的影响)

•可以使用Ar激光激发装置。

•【Quin 2】

•单波长激发

•激发:λex=339 nm、发射:λem=492 nm

•解离常数:110 nmol/L

•最早开发的产品

日本同仁化学Fluo 3-AM试剂货号:F026 CAS 121714-22-5- DOJINDO

上海金畔生物科技有限公司代理日本同仁化学 DOJINDO代理商全线产品,欢迎访问官网了解更多信息

Fluo 3-AM试剂货号:F026
Fluo3-AM1-[2-Amino-5-(2,7-dichloro-6-acetoxymethoxy-3-oxo-9-xanthenyl)phenoxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid, tetra(acetoxymethyl)ester
121714-22-5
商品信息
储存条件:-20度保存,避光
运输条件:室温
分子式:

C51H50Cl2N2O23

分子量:

1129.85

 

特点:

 

● 激发波长480-500 nm,发射波长523-530 nm

● 激光共聚焦,流式细胞仪均可检测

 

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50ug
50ug*8

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钙离子检测方案

Fluo 3-AM试剂货号:F026  CAS  121714-22-5

Fluo 3-AM试剂货号:F026  CAS  121714-22-5

产品性状
产品概述
原理
激发发射波长
操作步骤
注意事项
实验案例
数据分析
文献
Q&A

产品性状

规格

性状 :                      本产品为红色粉末,使用时将固体溶解于无水DMSO中

纯度(HPLC):          98%以上

 

荧光光谱图:             符合实验要求

NMR光谱图:            符合实验要求

处理条件

保存方法 :                避光冷冻

产品概述

Fluo 3-AM是一种检测细胞内钙离子的荧光探针。Fluo 3若以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的,但是当它与钙离子Ca2+结合后荧光会增加60至80倍,是目前最常用的一种钙离子荧光探针。激光共聚焦荧光显微镜具有氩激光器,所以Fluo 3可被广泛使用于这种显微镜上。这种荧光信号发出来的长波也便于减小对样品细胞的光损伤。Fluo 3也可用来检测紫外光照射下可裂解的螯合钙或其它形式的钙。Fluo 3-AM是Fluo 3的一种乙酰甲酯衍生物,通过培养,能够轻易进入细胞中。

原理

Fluo 3-AM (钙离子荧光探针) 需用无水DMSO (anhydrous DMSO)配制。Fluo 3-AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo 3-AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo 3,从而被滞留在细胞内。Fluo 3可以和钙离子结合,结合钙离子后可以产生较强的荧光,最大激发波长为506nm,最大发射波长为526nm

激发发射波长

E x :480-500 nm

Em:525-530 nm

操作步骤

1、用 HBSS 溶液稀释 1-5 mmol/l 的 Fluo 3-AM 母液,配制成 1-5 µmol/l的 Fluo 3-AM 工作液

(此浓度仅供参考,请根据具体实验要求自行调整)。

例如:1 mmol/l 母液配制 1 ml 浓度为 5 µmol/l工作液的方法:用 1 ml HBSS 溶液稀释 5 µl母液

即可。Fluo 3-AM 工作液需要即配即用,请勿反复冻存。如果Fluo 3-AM进入细胞的效果不好,

可使用Pluronic® F-127,后者可以防止Fluo 3-AM在缓冲液里聚合并能促进其进入细胞。

*Pluronic® F-127先用DMSO溶解至浓度为 20%(W/V),然后根据实验需要直接加入Fluo 3-AM工作液

中至终浓度为 0.04-0.05%(此浓度仅供参考,请根据具体实验要求自行调整)。

2、取出预培养的细胞,除去培养基,用 HBSS 溶液洗涤细胞 3 次。

如果使用含血清的培养基,血清中的酯酶会分解 AM 体,从而降低 Fluo 3-AM 进入细胞的效果。

另外含有酚红的培养基会使本底值略微偏高,所以加工作液之前需尽量去除培养基残留。

3、加入 Fluo 3-AM 工作液,溶液量以覆盖细胞为准。

4、37℃细胞培养箱孵育10-60分钟,除去Fluo 3-AM工作液。关于孵育的时间,如果首次做实验不能定,

建议先孵育 30 分钟,看荧光效果:如果细胞死亡较多,适当缩短时间;如果荧光强度太弱,

适当延长时间。

5、用 HBSS 溶液洗涤细胞 3 次以充分去除残留的 Fluo 3-AM 工作液。然后加入 HBSS 溶液覆盖细胞。

6、37℃培养箱孵育约 20-30 分钟,以确保 AM 体在细胞内的完全去酯化作用。

如果细胞内酯酶活性较低,建议严格按照此操作进行;酯酶活性高的细胞实验,可以忽略此步。

7、用激光共聚焦或荧光显微镜检测细胞,激发波长 480-500 nm,发射波长 525-530 nm。

注意事项

1、试剂容易吸潮,从冰箱取出后,请确认在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂极其微量,

开封前,请轻弹管壁几次,以保证粉末落入管底。

2、第一次使用时, 建议母液即配即用。试剂溶解后尽可能在短时间内使用,以保证实验效果。

3、溶解液DMSO需要保证新鲜无水,否则将会导致AM体水解,荧光染料无法进入细胞,影响实验效果

4、母液遇水极易分解,如果不能一次用完,建议分装保存,例如分装成5 μl/管,用封口膜封口,并用铝

箔纸包裹,放在一个密闭性能好的塑料袋中,并放入一包干燥剂,在≤-20℃密封避光保存。

5、建议您在正式实验前先摸索一下细胞量、钙离子荧光探针的终浓度、培养时间等,找到最佳实验条件

实验案例

加载了Fluo 3的新鲜分离的大鼠肝脏细胞PE刺激后出现规则胞浆钙振荡。

上图为细胞明场图和不同时间点(min)的比例成像,

下图为影响Fluo 3荧光强度随时间的变化。

成像系统:Photon Technology International Inc.,

显微镜Nikon TE2000U,CCD相机QuantEM512S,软件ERP。

(北京师范大学细胞生物学研究所 崔宗杰教授 提供照片)

 

数据分析

计算公式:

[Ca2+]i = Kd×(F-Fmin) / (Fmax-F)

[Ca2+]i :细胞内Ca2+浓度

Kd:解离常数

F  :荧光强度

Fmin:Ca2+为零状态下测得的荧光比值

Fmax:Ca2+为饱和状态下测得的荧光比值

文献

1) A. Minta, J. P. Y. Kao and R. Y. Tsien, “Fluorescent Indicators for Cytosolic Calcium Based on Rhodamine and Fluorescein Chromophores”, J. Biol. Chem., 1989, 264(14), 8171.

2) J. P. Kao, A. T. Harootunian and R. Y. Tsien, “Photochemically Generated Cytosolic Calcium Pulses and Their Detection by Fluo-3”, J. Biol. Chem., 1989, 264, 8179.

3) M. Eberhard and P. Erne, “Kinetics of Calcium Binding to Fluo-3 by Stopped-Flow Fluorescence”, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1989, 163, 309.

4) A. Hernandez-Cruz, F. Sala and P. R. Adams, “Subcellular Calcium Transients Visualized by Confocal Microscopy in a Voltage-clamped Vertebrate Neuron”, Science, 1990, 247, 858.

5) A. H. Cornell-Bell, S. M. Finkbeiner, M. S. Cooper and S. J. Smith, “Glutamate Induces Calcium Waves in Cultured Astrocytes: Long-Range Glial Signaling”, Science, 1990, 247, 470.

6) D. A. Williams, “Quantitative Intracellular Calcium Imaging with Laser-scanning Confocal Microscopy”, Cell Calcium, 1990, 11, 589.

7) D. A. Williams, S. H. Cody, C. A. Gehring, R. W. Parish and P. J. Harris, “Confocal Imaging of Ionised Calcium in Living Plant Cells”, Cell Calcium, 1990, 11, 291.

8) P. A. Vandenberghe and J. L. Ceuppens, “Flow Cytometric Measurement of Cytoplasmic Free Calcium in Human Peripheral Blood T Lymphocytes with Fluo-3, A New Fluorescent Calcium Indicator”, J. Immunol. Methods, 1990, 127, 197.

10) M. Iino, H. Kasai and T. Yamazawa, “Visualization of Neural Control of Intracellular Ca2+ Concentration in Single Vascular Smooth Muscle Cells in situ”, EMBO J., 1994, 13 (21), 5026.

11) M. E. Dailey and S. J. Smith, “Spontaneous Ca2+ Transients in Developing Hippocampal Pyramidal Cells”, J. Neurobiol., 1994, 25(3), 243.

12) M. Burnier, G. Centeno, E. Burki and H. R. Brunner, “Confocal Microscopy to Analyze Cytosolic and Nuclear Calcium in Cultured Vascular Cells”, Am. J. Physiol., 1994, 266, C1118.

13) E. Donnadieu and L. Y. W. Bourguignon, “Ca2+ Signaling in Endothelial Cells Stimulated by Bradykinin: Ca2+ Measurement in the Mitochondria and the Cytosol by Confocal Microscopy”, Cell Calcium, 1996, 20 (1), 53.

14) M. Ikeda, H. Ariyoshi, J. Kambayashi, K. Fujitani, N. Shinoki, M. Sakon, T. Kawasaki and M. Monden, “Separate Analysis of Nuclear and Cytosolic Ca2+ Concentrations in Human Umbilical Vein Endothelial Cells”, J. Cell. Biochem., 1996, 63 (1), 23.

15) J. E. Merritt, S. A. McCarthy, M. P. A. Davies and K. E. Moores, “Use of fluo-3 to Measure Cytosolic Ca2+ in Platelets and Neutrophils Loading Cells with the Dye, Calibration of Traces, Measurements in the Presence of Plasma, and Buffering of Cytosolic Ca2+”, Biochem. J., 1990, 269, 513.

Q&A

 

 

 

Q1: 细胞内检测钙离子的试剂种类都有什么,选择什么样的比较好呢?

 

 

A1: 根据检测仪器和检测波长有很多的选择,产品后面标有AM的试剂是可以通过细胞膜的

有很多种相似的试剂,其特点如下:

【Fura 2】

•双波长激发

激发(λex= Ca:340 nm, Ca free:380 nm)、发射:λem=500 nm

•解离常数:224 nmol/L

•因为是荧光强度的比值、可以有效的减小误差

=>細胞内Ca浓度计算。

•该试剂被使用的最多

•必须要更换过滤片、会耽误一些时间。

【Fluo 3】

•单波长激发

激发:λex=508 nm、发射:λem=527 nm

•解离常数:400 nmol/L

•因为激发光在长波段,所以对细胞的损伤比较小

(不会受到NADH、NADPH的影响)

•可以使用Ar激光激发装置。

•不适合切片中钙离子的检测

•【Fluo 4】

•单波长激发

•激发:λex=495 nm、发射:λem=518 nm

•解离常数:360 nmol/L

•与Fluo3相比对荧光强度更高。

•因为激发光在长波段,所以对细胞的损伤比较小

•(不会受到NADH、NADPH的影响)

•可以使用Ar激光激发装置。 •与Fluo3相比对細胞的毒性低

•【Indo 1】

•单波长激发

•激发:λex= 330 nm、发射(λem= Ca:410 nm, Ca free:485 nm)

•解离常数:250 nmol/L

•由于不需要更换滤光片,可以很快地检测细胞内钙离子浓度变化以及像心肌细胞运动中钙离子的变化

•(需要两台检测仪器)

•【Rhod 2】

•单波长激发

•激发:λex=553 nm、发射:λem=576 nm

•解离常数:1.0 μmol/L

•因为激发光在长波段,所以对细胞的损伤比较小

•(不会受到NADH、NADPH的影响)

•可以使用Ar激光激发装置。

•【Quin 2】

•单波长激发

•激发:λex=339 nm、发射:λem=492 nm

•解离常数:110 nmol/L

•最早开发的产品

日本同仁化学Fura2-AM special packaging试剂货号:F025 CAS号:108964-32-5- DOJINDO

上海金畔生物科技有限公司代理日本同仁化学 DOJINDO代理商全线产品,欢迎访问官网了解更多信息

Fura2-AM special packaging试剂货号:F025
1-[6-Amino-2-(5-carboxy-2-oxazolyl)-5-benzofuranyloxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid, pentaacetoxymethyl ester
CAS号:108964-32-5
商品信息
储存条件:-20度保存
运输条件:室温
分子式:

C44H47N3O24

分子量:

1001.85

 

 

特点:

 

● 双波长激发检测钙离子

● 激光共聚焦,流式细胞仪均可检测

● 荧光强度高

 

 

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钙离子

Fura2-AM special packaging试剂货号:F025  CAS号:108964-32-5

Fura2-AM special packaging试剂货号:F025  CAS号:108964-32-5

产品性状
产品概述
原理
激发发射波长
操作步骤
注意事项
数据处理
参考文献
Q&A

产品性状

规格

性状 :                      本产品为黄色或橙黄色粉末,使用时将固体溶解于无水DMSO中

纯度(HPLC):          98%以上

荧光光谱图:             符合实验要求

NMR光谱图:            符合实验要求

处理条件

保存方法 :                避光冷冻

产品概述

Fura 2-AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fura 2-AM的荧光比较弱,最大激发波长为369 nm,最大发射波长为478 nm,并且其荧光不会随钙离子浓度改变而改变。Fura 2-AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fura 2,从而被滞留在细胞内。Fura 2和钙离子结合后,最大激发波长为335 nm(最大激发波长随离子浓度的的不同而有所不同),最大发射波长为505nm。实际检测时推荐使用的激发波长为340nm,发射波长为510 nm。如果做双波长检测,则推荐使用的激发波长为340 nm和380 nm。

原理

Fura 2可以和钙离子(Ca2+)结合,结合钙离子后在330-350 nm激发光下可以产生较强的荧光,而在380 nm激发光下则会导致荧光减弱。这样就可以使用340 nm和380 nm这两个荧光的比值来检测细胞内的钙离子浓度,可以消除不同细胞样品间荧光探针装载效率的差异,荧光探针的渗漏,细胞厚度差异等一些误差因素。

激发发射波长

Ex :340~380 nm

Em :510 nm

Fura2-AM special packaging试剂货号:F025  CAS号:108964-32-5

操作步骤

1、用HBSS溶液稀释1-5 mmol/l的Fura 2-AM母液,配制成1-5 μmol/l的Fura 2-AM工作液。

(此浓度仅供参考,请根据具体实验要求自行调整)

例如:1 mmol/l母液配制1 ml浓度为5 μmol/l工作液的方法:用1 ml HBSS溶液稀释5μl母液即可。

如果Fura 2-AM进入细胞的效果不好,可使用Pluronic® F-127,后者可以防止Fura 2-AM在缓冲液里

聚合并能促进其进入细胞。

*Pluronic® F-127先用DMSO溶解至浓度为20%(W/V),然后根据实验需要直接加入Fura 2-AM工作液

中至终浓度为0.04-0.05%(此浓度仅供参考,请根据具体实验要求自行调整)。

2、取出预培养的细胞,除去培养基,使用HBSS溶液洗涤细胞3次。

如果使用含血清的培养基,血清中的酯酶会分解AM体,从而降低Fura 2-AM进入细胞的效果。

另外含有酚红的培养 基会使本底值略微偏高,所以加工作液之前需尽量去除培养基残留。

3、加入Fura 2-AM工作液,溶液量以覆盖细胞为准。

4、37℃细胞培养箱孵育10-60分钟,除去Fura 2-AM工作液。关于孵育的时间,如果首次做实验不能定

建议先孵育30分钟,看荧光效果:如果细胞死亡较多,缩短时间;荧光强度太弱,延长时间。

5、用HBSS溶液洗涤细胞3次,以充分去除残留的Fura 2-AM工作液。然后加入HBSS溶液覆盖细胞。

6、37℃培养箱孵育约20-30分钟,以确保AM体在细胞内的完全去酯化作用。如果细胞内酯酶活性较低,

建议严格按照此操作进行;酯酶活性高的细胞实验,可以忽略此步。

7、用流式细胞仪或其它设备检测细胞,激发波长380 nm(Fura 2)和340 nm(钙离子-Fura 2),

发射波长510 nm。

注意事项

1、试剂容易吸潮,从冰箱取出后,请确认在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂极其微量,

开封前,请轻弹管壁几次,以保证粉末落入管底。

2、第一次使用时, 建议母液即配即用。试剂溶解后尽可能在短时间内使用,以保证实验效果。

3、溶解液DMSO需要保证新鲜无水,否则将会导致AM体水解,使荧光染料无法进入细胞,影响实验效果。

4、母液遇水极易分解,如果不能一次用完,建议分装保存,例如分装成5 μl/管,用封口膜封口,并用铝箔纸包裹,

放在一个密闭性能好的塑料袋中,并放入一包干燥剂,在≤-20℃密封避光保存。

5、建议您在正式实验前先摸索一下细胞量、钙离子荧光探针的终浓度、培养时间等,找到最佳实验条件。

数据处理

Fλ1与Fλ2分别是λ1与λ2激发时的总荧光强度,Sf 1与Sf 2是两种紫外光激发时游离Fura-2 (未结合Ca2+)的荧光系数,

Cf是游离的Fura-2浓度,Sb1与Sb2是相应波长下结合Ca2+后Fura-2的荧光系数,Cb是结合Ca2+的Fura-2浓度

参考文献

1) G. Grynkiewicz, M. Poenie and R. Y. Tsien, “A New Generation of Ca2+ Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties”, J. Biol. Chem., 1985, 260, 3440.

2) D. A. Williams, K. E. Fogarty, R. Y. Tsien and F. S. Fay, “Calcium Gradients in Single Smooth Muscle Cells Revealed by the Digital Imaging Microscope Using Fura-2”, Nature, 1985, 318, 558.

3) R. Y. Tsien, T. J. Rink and M. Poenie, “Measurement of Cytosolic Free Ca2+ in Individual Small Cells Using Fluorescence Microscopy with Dual Excitation Wavelengths”, Cell Calcium, 1985, 6, 145.

4) D. A. Williams and F. S. Fay, “Intracellular Calibration of the Fluorescent Calcium Indicator Fura-2”, Cell Calcium, 1990, 11, 75.

5) W. Almers and E. Neher, “The Ca Signal from Fura-2 Loaded Mast Cells Depends Strongly on the Method of Dye-loading”, FEBS Lett., 1985, 192, 13.

6) G. H. R. Rao, J. D. Peller and J. G. White, “Measurement of Ionized Calcium in Blood Platelets with a New Generation Calcium Indicator”, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1985, 132, 652.

7) H. Ozaki, K. Sato, T. Satoh and H. Karaki, “Simultaneous Recordings of Calcium Signals and Mechanical Activity Using Fluorescent Dye Fura 2 in Isolated Strips of Vascular Smooth Muscle”, Jpn. J. Pharmacol., 1987, 45, 429.

8) M. Mitsui, A. Abe, M. Tajimi and H. Karaki, “Leakage of the Fluorescent Ca2+ Indicator Fura-2 in Smooth Muscle”, Jpn. J. Pharmacol., 1993, 61, 165.

Q&A

 

 

 

Q1: 细胞内检测钙离子的试剂种类都有什么,选择什么样的比较好呢?

 

 

A1: 根据检测仪器和检测波长有很多的选择,产品后面标有AM的试剂是可以通过细胞膜的

有很多种相似的试剂,其特点如下:

【Fura 2】

•双波长激发

激发(λex= Ca:340 nm, Ca free:380 nm)、发射:λem=500 nm

•解离常数:224 nmol/L

•因为是荧光强度的比值、可以有效的减小误差

=>細胞内Ca浓度计算。

•该试剂被使用的最多

•必须要更换过滤片、会耽误一些时间。

【Fluo 3】

•单波长激发

激发:λex=508 nm、发射:λem=527 nm

•解离常数:400 nmol/L

•因为激发光在长波段,所以对细胞的损伤比较小

(不会受到NADH、NADPH的影响)

•可以使用Ar激光激发装置。

•不适合切片中钙离子的检测

•【Fluo 4】

•单波长激发

•激发:λex=495 nm、发射:λem=518 nm

•解离常数:360 nmol/L

•与Fluo3相比对荧光强度更高。

•因为激发光在长波段,所以对细胞的损伤比较小

•(不会受到NADH、NADPH的影响)

•可以使用Ar激光激发装置。 •与Fluo3相比对細胞的毒性低

•【Indo 1】

•单波长激发

•激发:λex= 330 nm、发射(λem= Ca:410 nm, Ca free:485 nm)

•解离常数:250 nmol/L

•由于不需要更换滤光片,可以很快地检测细胞内钙离子浓度变化以及像心肌细胞运动中钙离子的变化

•(需要两台检测仪器)

•【Rhod 2】

•单波长激发

•激发:λex=553 nm、发射:λem=576 nm

•解离常数:1.0 μmol/L

•因为激发光在长波段,所以对细胞的损伤比较小

•(不会受到NADH、NADPH的影响)

•可以使用Ar激光激发装置。

•【Quin 2】

•单波长激发

•激发:λex=339 nm、发射:λem=492 nm

•解离常数:110 nmol/L

•最早开发的产品

日本同仁化学Fura2-AM试剂货号:F015 CAS号:108964-32-5- DOJINDO

上海金畔生物科技有限公司代理日本同仁化学 DOJINDO代理商全线产品,欢迎访问官网了解更多信息

Fura2-AM试剂货号:F015
1-[6-Amino-2-(5-carboxy-2-oxazolyl)-5-benzofuranyloxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid, pentaacetoxymethyl ester
CAS号:108964-32-5
商品信息
储存条件:-20度保存
运输条件:室温
分子式:

C44H47N3O24

分子量:

1001.85

 

特点:

 

● 双波长激发检测钙离子

● 激光共聚焦,流式细胞仪均可检测

● 荧光强度高

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1mg

现货 

 
钙离子

Fura2-AM试剂货号:F015 CAS号:108964-32-5

Fura2-AM试剂货号:F015 CAS号:108964-32-5

产品性状
产品概述
原理
激发发射波长
操作步骤
注意事项
数据处理
参考文献
Q&A

产品性状

规格

性状 :                      本产品为黄色或橙黄色粉末,使用时将固体溶解于无水DMSO中

纯度(HPLC):          98%以上

荧光光谱图:             符合实验要求

NMR光谱图:            符合实验要求

处理条件

保存方法 :                避光冷冻

产品概述

Fura 2-AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fura 2-AM的荧光比较弱,最大激发波长为369 nm,最大发射波长为478 nm,并且其荧光不会随钙离子浓度改变而改变。Fura 2-AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fura 2,从而被滞留在细胞内。Fura 2和钙离子结合后,最大激发波长为335 nm(最大激发波长随离子浓度的的不同而有所不同),最大发射波长为505nm。实际检测时推荐使用的激发波长为340nm,发射波长为510 nm。如果做双波长检测,则推荐使用的激发波长为340 nm和380 nm。

原理

Fura 2可以和钙离子(Ca2+)结合,结合钙离子后在330-350 nm激发光下可以产生较强的荧光,而在380 nm激发光下则会导致荧光减弱。这样就可以使用340 nm和380 nm这两个荧光的比值来检测细胞内的钙离子浓度,可以消除不同细胞样品间荧光探针装载效率的差异,荧光探针的渗漏,细胞厚度差异等一些误差因素。

激发发射波长

Ex :340~380 nm

Em :510 nm

Fura2-AM试剂货号:F015 CAS号:108964-32-5

操作步骤

1、用HBSS溶液稀释1-5 mmol/l的Fura 2-AM母液,配制成1-5 μmol/l的Fura 2-AM工作液。

(此浓度仅供参考,请根据具体实验要求自行调整)

例如:1 mmol/l母液配制1 ml浓度为5 μmol/l工作液的方法:用1 ml HBSS溶液稀释5 μl母液即可。

如果Fura 2-AM进入细胞效果不好,可使用Pluronic® F-127后者可以防止Fura 2-AM在缓冲液里聚合

并能促进其进入细胞。

*Pluronic® F-127先用DMSO溶解至浓度为20%(W/V),然后根据实验需要直接加入Fura 2-AM工作液中

至终浓度为0.04-0.05%(此浓度仅供参考,请根据具体实验要求自行调整)。

2、取出预培养的细胞,除去培养基,使用HBSS溶液洗涤细胞3次。

如果使用含血清的培养基,血清中的酯酶会分解AM体,从而降低Fura 2-AM进入细胞的效果。

另外含有酚红的培养 基会使本底值略微偏高,所以加工作液之前需尽量去除培养基残留。

3、加入Fura 2-AM工作液,溶液量以覆盖细胞为准。

4、37℃细胞培养箱孵育10-60分钟,除去Fura 2-AM工作液。关于孵育的时间,

如果首次做实验不能确定,建议先孵育30分钟,看荧光效果:如果细胞死亡较多,缩短时间;

荧光强度太弱,延长时间。

5、用HBSS溶液洗涤细胞3次,以充分去除残留的Fura 2-AM工作液。然后加入HBSS溶液覆盖细胞。

6、37℃培养箱孵育约20-30分钟,以确保AM体在细胞内的完全去酯化作用。如果细胞内酯酶活性较低,

建议严格按照此操作进行;酯酶活性高的细胞实验,可以忽略此步。

7、用流式细胞仪或其它设备检测细胞,激发波长380 nm(Fura 2)和340 nm(钙离子-Fura 2)

发射波长510 nm。

注意事项

1、试剂容易吸潮,从冰箱取出后,请确认在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂极其微量,

开封前,请轻弹管壁几次,以保证粉末落入管底。

2、第一次使用时, 建议母液即配即用。试剂溶解后尽可能在短时间内使用,以保证实验效果。

3、溶解液DMSO需要保证新鲜无水,否则将会导致AM体水解,使荧光染料无法进入细胞,影响实验效果。

4、母液遇水极易分解,如果不能一次用完,建议分装保存,例如分装成5 μl/管,用封口膜封口,

并用铝箔纸包裹,放在一个密闭性能好的塑料袋中,并放入一包干燥剂,在≤-20℃密封避光保存。

5、建议您在正式实验前先摸索一下细胞量、钙离子荧光探针的终浓度、培养时间等,找到最佳实验条件

数据处理

Fλ1与Fλ2分别是λ1与λ2激发时的总荧光强度,Sf 1与Sf 2是两种紫外光激发时游离Fura-2 (未结合Ca2+)的荧光系数,

Cf是游离的Fura-2浓度,Sb1与Sb2是相应波长下结合Ca2+后Fura-2的荧光系数,Cb是结合Ca2+的Fura-2浓度

 

参考文献

1) G. Grynkiewicz, M. Poenie and R. Y. Tsien, “A New Generation of Ca2+ Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties”, J. Biol. Chem., 1985, 260, 3440.

2) D. A. Williams, K. E. Fogarty, R. Y. Tsien and F. S. Fay, “Calcium Gradients in Single Smooth Muscle Cells Revealed by the Digital Imaging Microscope Using Fura-2”, Nature, 1985, 318, 558.

3) R. Y. Tsien, T. J. Rink and M. Poenie, “Measurement of Cytosolic Free Ca2+ in Individual Small Cells Using Fluorescence Microscopy with Dual Excitation Wavelengths”, Cell Calcium, 1985, 6, 145.

4) D. A. Williams and F. S. Fay, “Intracellular Calibration of the Fluorescent Calcium Indicator Fura-2”, Cell Calcium, 1990, 11, 75.

5) W. Almers and E. Neher, “The Ca Signal from Fura-2 Loaded Mast Cells Depends Strongly on the Method of Dye-loading”, FEBS Lett., 1985, 192, 13.

6) G. H. R. Rao, J. D. Peller and J. G. White, “Measurement of Ionized Calcium in Blood Platelets with a New Generation Calcium Indicator”, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1985, 132, 652.

7) H. Ozaki, K. Sato, T. Satoh and H. Karaki, “Simultaneous Recordings of Calcium Signals and Mechanical Activity Using Fluorescent Dye Fura 2 in Isolated Strips of Vascular Smooth Muscle”, Jpn. J. Pharmacol., 1987, 45, 429.

8) M. Mitsui, A. Abe, M. Tajimi and H. Karaki, “Leakage of the Fluorescent Ca2+ Indicator Fura-2 in Smooth Muscle”, Jpn. J. Pharmacol., 1993, 61, 165.

Q&A

 

 

 

Q1: 细胞内检测钙离子的试剂种类都有什么,选择什么样的比较好呢?

 

 

A1: 根据检测仪器和检测波长有很多的选择,产品后面标有AM的试剂是可以通过细胞膜的

有很多种相似的试剂,其特点如下:

【Fura 2】

•双波长激发

激发(λex= Ca:340 nm, Ca free:380 nm)、发射:λem=500 nm

•解离常数:224 nmol/L

•因为是荧光强度的比值、可以有效的减小误差

=>細胞内Ca浓度计算。

•该试剂被使用的最多

•必须要更换过滤片、会耽误一些时间。

【Fluo 3】

•单波长激发

激发:λex=508 nm、发射:λem=527 nm

•解离常数:400 nmol/L

•因为激发光在长波段,所以对细胞的损伤比较小

(不会受到NADH、NADPH的影响)

•可以使用Ar激光激发装置。

•不适合切片中钙离子的检测

•【Fluo 4】

•单波长激发

•激发:λex=495 nm、发射:λem=518 nm

•解离常数:360 nmol/L

•与Fluo3相比对荧光强度更高。

•因为激发光在长波段,所以对细胞的损伤比较小

•(不会受到NADH、NADPH的影响)

•可以使用Ar激光激发装置。 •与Fluo3相比对細胞的毒性低

•【Indo 1】

•单波长激发

•激发:λex= 330 nm、发射(λem= Ca:410 nm, Ca free:485 nm)

•解离常数:250 nmol/L

•由于不需要更换滤光片,可以很快地检测细胞内钙离子浓度变化以及像心肌细胞运动中钙离子的变化

•(需要两台检测仪器)

•【Rhod 2】

•单波长激发

•激发:λex=553 nm、发射:λem=576 nm

•解离常数:1.0 μmol/L

•因为激发光在长波段,所以对细胞的损伤比较小

•(不会受到NADH、NADPH的影响)

•可以使用Ar激光激发装置。

•【Quin 2】

•单波长激发

•激发:λex=339 nm、发射:λem=492 nm

•解离常数:110 nmol/L

•最早开发的产品

日本同仁化学BAPTA-AM试剂货号:B018 CAS号:126150-97-8- DOJINDO

上海金畔生物科技有限公司代理日本同仁化学 DOJINDO代理商全线产品,欢迎访问官网了解更多信息

BAPTA-AM试剂货号:B018
O,O’-Bis(2-aminophenyl)ethyleneglycol-N,N,N’,N’-tetraacetic acid, tetraacetoxymethyl ester
CAS号:126150-97-8
商品信息
储存条件:-20度保存
运输条件:室温
分子式:

C34H40N2O18

分子量:

764.68

特点:

 

● 螯合率高于EGTA

● 可螯合细胞内的钙离子

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选择规格:
25mg

现货 

 
荧光探针检测方案

性质
参考文献
规格性状

性质

BAPTA-AM是BAPTA羧基的乙酰氧基甲基酯化产物,可以很容易地吸收到细胞中。 该酯被细胞内酯酶分解,显示出主体在细胞中作为BAPTA的功能。 生成的BAPTA保留在细胞内部。

参考文献

1) R. Y. Tsien, “New Calcium Indicators and Buffers with High Selectivity against Magnesium and Protons: Design, Synthesis, and Properties of Prototype Structures”, Biochemistry198019 (11), 2396.
2) R. Y. Tsien, “A Non-disruptive Technique for Loading Calcium Buffers and Indicators into Cells”, Nature1981290, 527.
3) J. I. Korenbrot, D. L. Ochs, J. A. Williams, D. L. Miller and J. E. Brown, “The Use of Tetracarboxylate Fluorescent Indicators in the Measurement and Control of Intracellular Free Calcium Ions”, Soc. Gen. Physiol. Ser.198640, 347.
4) S. M. Harrison and D. M. Bers, “The Effect of Temperature and Ionic Strength on the Apparent Ca-affinity of EGTA and the Analogous Ca-chelators BAPTA and Dibromo-BAPTA”, Biochim. Biophys. Acta1987925, 133.
5) E. W. Gelfand and R. K. Cheung, “Dissociation of Unidirectional Influx of External Ca2+ and Release from Internal Stores in Activated Human T Lymphocytes”, Eur. J. Immunol.199020, 1237.
6) J. P. Kao, J. M. Alderton, R. Y. Tsien and R. A. Steinhardt, “Active Involvement of Ca2+ in Mitotic Progression of Swiss 3T3 Fibroblasts”, J. Cell Biol.1990111, 183.
7) M. L. Schubert and J. Hightower, “Functionally Distinct Muscarinic Receptors on Gastric Somatostatin Cells”, Am. J. Physiol.1990258, G982.
8) Y. Tojyo and Y. Matsumoto, “Inhibitory Effects of Loading with the Calcium-chelator 1, 2-Bis(o-aminophenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (BAPTA) on Amylase Release and Cellular ATP Level in Rat Parotid Cells”, Biochem. Pharmacol.199039(11), 1775.

规格性状

规格性状:

该产品为无色液体。

纯度(HPLC):98.0%以上

处理条件

1.危险物第4类,第3石油类,危险等级Ⅲ 2.无火 3.储存方法:冷冻,避光

日本同仁化学BCECF-AM试剂货号:B262 3′-O-Acetyl-2′,7′-bis(carboxyethyl)-4 or 5-carboxyfluorescein, diacetoxymethyl ester CAS号:117464-70-7- DOJINDO

上海金畔生物科技有限公司代理日本同仁化学 DOJINDO代理商全线产品,欢迎访问官网了解更多信息

BCECF-AM试剂货号:B262
3′-O-Acetyl-2′,7′-bis(carboxyethyl)-4 or 5-carboxyfluorescein, diacetoxymethyl ester
CAS号:117464-70-7
商品信息
储存条件:-20度保存,避光
运输条件:室温
分子式:

C35H28O15

分子量:

688.59

特点:

 

● 水溶性好,可进入细胞膜

● 荧光强度高

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选择规格:
1mg

现货

荧光探针检测方案

BCECF-AM试剂货号:B262 3′-O-Acetyl-2′,7′-bis(carboxyethyl)-4 or 5-carboxyfluorescein, diacetoxymethyl ester CAS号:117464-70-7

BCECF-AM试剂货号:B262 3′-O-Acetyl-2′,7′-bis(carboxyethyl)-4 or 5-carboxyfluorescein, diacetoxymethyl ester CAS号:117464-70-7

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NO.1.    Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit    细胞凋亡检测

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NO.4.    Cell Viability Assay Kit    细胞增殖/毒性检测

NO.5.    Fluo 4-AM special packaging    细胞内钙离子检测

 

规格性状

规格

 

特性:该产物为浅橙色至浅橙色棕色粉末或固体,可溶于DMSO和乙腈。

纯度(HPLC):90%以上

荧光光谱:试验成功

NMR光谱:试验成功

产品概述

BCECF被广泛地用于细胞内pH的测定。Tsien博士和其他人通过加入2个额外的羧化物基团改进了这种羧基荧光素。加入的两个羧基使得它能更好地被固定在细胞内。BCECF具有很好的水溶性,是因为它在中性pH时带有4-5个负电荷。但是BCECF却很难穿过细胞膜进入到细胞内。它的pKa值为6.97,高于其它的羧基荧光素。BCECF在激发光谱439nm处有等吸收点,因此它能和Fura 2一样可用比率法测定。505nm和439nm通常是非常有用的用于比率测量的波长,一般会将490nm和450nm的滤光片加在激发光源的前面。而530nm的滤光片则是用来查看它的荧光信号的。这里要注意的是激发光谱与吸收光谱有一些细微的区别。BCECF-AM是乙酰甲酯化的BCECF。它能够轻易地进入到细胞内。就和其他的乙酰甲酯类一样,BCECF-AM只需要通过孵育就能进入细胞。BCECF-AM对潮湿非常敏感,所以要小心保存。如果DMSO储存液的颜色从浅黄色变为深橙色就代表了AM的分解。所以通过对颜色变化的观测,能判断AM酯的水解情况。

BCECF-AM试剂货号:B262 3′-O-Acetyl-2′,7′-bis(carboxyethyl)-4 or 5-carboxyfluorescein, diacetoxymethyl ester CAS号:117464-70-7

产品特性

BCECF-AM是一种对细胞内pH敏感的新型荧光探针,分别用490nm和440nm波长激发BCECF所得到的发射荧光之比与pH有很好的线性关系。BCECF-AM是乙酰甲酯化的BCECF,BCECF-AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料,BCECF-AM没有荧光,进入细胞后被细胞内的酯酶水解成BCECF,从而被留在细胞内。BCECF在适当的pH值情况下可以被激发形成绿色荧光。BCECF-AM不仅被广泛用于哺乳动物细胞的研究,也有报道用于动物组织、植物细胞、细菌和酵母等的细胞内pH水平检测。在有细胞内pH变化的细胞毒性、细胞凋亡、细胞粘附、药物抵抗、细胞趋化等过程中BCECF AM被广泛应用。BCECF-AM(pH荧光探针)需用无水DMSO(anhydrous DMSO)配制。

BCECF-AM试剂货号:B262 3′-O-Acetyl-2′,7′-bis(carboxyethyl)-4 or 5-carboxyfluorescein, diacetoxymethyl ester CAS号:117464-70-7

操作说明

试剂 (溶解方法):   

1.45 mM的BCECF-AM/DMSO溶液(将1 mg 的BCECF-AM溶于1mlDMSO)HEPES缓冲液(20mM HEPES,153mM NaCl,5mM KCl,5mM glucose,pH7.4)

操作:

1.用HEPES制备细胞悬液,细胞浓度为4×107个/ml。

2.将1.45 mM的BCECF-AM/DMSO溶液加入细胞悬液中 (细胞悬液的1/300体积),BCECF-AM终浓度为3mM。

3.37℃培养30min。

4.用HEPES缓冲液清洗细胞3次,制成3×106个/ml的细胞悬液。

5.使用荧光显微镜或带有图像分析系统的激光共聚焦显微镜检测细胞的荧光强度。

*标记的条件因细胞种类而异,在每次实验前,请先确定最佳条件。以上方法仅供参考。

BCECF-AM试剂货号:B262 3′-O-Acetyl-2′,7′-bis(carboxyethyl)-4 or 5-carboxyfluorescein, diacetoxymethyl ester CAS号:117464-70-7

文献

1.R.A.Steinhardt, et al.,Development of K+-conductance and Membrane Potentials in Unfertilized Sea Urchin Eggs After Exposure to NH4OH. Nature.1973;241:400-401.

2.T.J.Rink, et al.,Cytoplasmic pH and Free Mg2+ in Lymphocytes.J Cell Biol.1982;95:189-196.

3.A.M.Paradiso,et al.,Na+ -H+ Exchange in Gastric Glands as Measured with a Cytoplasmic-trapped, Fluorescent pH Indicator. PNAS.1984;81:7436-7440.

4.S.Grinstein,et al.,Phorbol Ester-induces Changes of Cytoplasmic pH in Neutrophils:Role of Exocytosis in Na+ – H+ Exchange.Am J Physiol.1985;248:C379-C386.

5.G.B.Zavoico, et al.,Regulation of intracellular pH in human platelets.Effects of thrombin,A23187,and ionomycin and evidence for activation of Na+/H+ exchange and its inhibition by amiloride analogs.J Biol Chem.1986;261:13160-13167.

6.G.R.Bright,et al.,Fluorescence Ratio Imaging Microscopy: Temporal and Spatial Measurements of Cytoplasmic pH.J Cell Biol.1987;104:1019-1033.

7.C.Aalkjaer,et al.,Intracellular pH Regulation in Resting and Contracting Segments of Rat Mesenteric Resistance Vessels. J Physiol.1988;402:391-410.

8.K.Tsujimoto,et al.,Intracellular pH of Halobacteria Can Be Determined by the Fluorescent Dye 2 E 7 Ebis(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein.Biochem Biophys Res Commun.1988;155:123-129.

9.M.A.Kolber,et al.,Measurament of Cytotoxicity by Target Cell Release and Retention of the Fluorescent Dye Bis-carboxyethylcarboxyfluorescein(BCECF).J Immunol Methods.1988;108:255-264.

10.H.Harada,et al.,cAMP Activates Cl-/HCO3 – Exchange for  Regulation of Intracellular pH in Renal Epithelial Cells. Biochim Biophys  Acta. 1991;1092:404-407.11.C.C. Freudenrich, et al.,Intracellular pH Modulates  Cytosolic Free Magnesium in Cultured Chicken Heart Cells.Am J Physiol.1992;262:C1024-C1030.

12.K.Khodakhah,et al.,Functional Heterogeneity of Calcium  Release by Inositol Triphosphate in Single Purkinje Neurones, Cultured  Cerebellar Astorocytes, and Peripheral Tissues. PNAS. 1993;90:4976-4980.

13.G.Boyarsky,et al.,Superiority of in vitro Over in vivo Calibrations of BCECF in Vascular Smooth Muscle Cells. FASEB J.1996;10:1205-1212.

14.S.A. Weston,et al., New Fluorescent Dyes for Lymphocyte  Migration Studies Analysis by Flow Cytometry and Fluorescent Microscopy.J Immunol Methods.1990;133:87-97.

15.L.S.De Clerck,et al.,Use of Fluorescent Dyes in the Determination of Adherence of Human Leucocytes to Endothelial Cells and the Effects of Fluorochromes on Cellular Function.J Immunol Methods.1994;172:115-124.

日本同仁化学FDA试剂货号:F209 Fluorescein diacetate- DOJINDO

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FDA试剂货号:F209
Fluorescein diacetate
Fluorescein diacetate
商品信息
储存条件:0-5度保存,避光
运输条件:室温
分子式:

C24H16O7

分子量:

416.38

特点:

 

● 激发和发射波长分别为488 nm和530 nm

● 可用于流式细胞仪

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1mg

期货

细胞染色

FDA试剂货号:F209 Fluorescein diacetate

FDA试剂货号:F209 Fluorescein diacetate

规格性状
产品概述
荧光特性
参考文献
常见问题Q&A

规格性状

规格

特性:该产物为白色结晶粉末或固体,可溶于二甲基亚砜。

可溶于二甲基亚砜:试验成功

NMR光谱:试验成功

产品概述

FDA可透过细胞膜并作为荧光素积蓄在活细胞内。由于荧光素较BCECF或Calcein的亲水性低,因此荧光素从细胞中渗漏的量也高。FDA也可用于流式细胞仪。荧光素的激发和发射波长分别为488 nm和530 nm。

荧光特性

荧光特性:λex=488 nm, λem=530 nm

参考文献

1) B. Rotman and B. W. Papermaster, “Membrane Properties of Living Mammalian Cells as Studied by Enzymatic Hydrolysis of Fluorogenic Esters”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1966, 55, 134.

2) H. R. Hulett, W. A. Bonner, J. Barrett and L. A. Herzenberg, “Cell Sorting: Automated Separation of Mammalian Cells as a Function of Intercellular Fluorescence”, Science, 1969, 166, 747.

3) K. H. Jones and J. A. Senft, “An Improved Method to Determine Cell Viability by Simultaneous Staining with Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide”,J.Histochem.Cytochem., 1985, 33, 77.

4) K. McGinnes, G. Chapman, R. Marks and R. Penny, “A Fluorescence NK Assay Using Flow Cytometry”, J. Immunol. Methods, 1986, 86, 7.

5) W. M. J. Vuist, F. V. Buitenen, M. A. De Rie, A. Hekman, P. Ruemke and C. J. M. Melief, “Potentiation by Interleukin 2 of Burkitt’s Lymphoma Therapy with Anti-Pan B (Anti-CD19) Monoclonal Antibodies in a Mouse Xenotransplantation Model”, Cancer Res., 1989, 49, 3783.

6) E. Prosperi, “Intracellular Turnover of Fluorescein Diacetate. Influence of Membrane Ionic Gradients on Fluorescein Efflux”, Histochem.J., 1990, 22, 227.

常见问题Q&A

Q1:如何使用FDA。

 

 

 

 

 

A1:下面给出一个例子。请根据细胞的种类,观察条件讨论细胞的固定和试剂浓度。

【例1】HeLa细胞的形态观察

将1mg的FDA溶解在2ml的DMSO中(储存溶液)

用PBS(-)溶液稀释,设为2μmol/L。(用5ml PBS(-)稀释8μl贮存溶液)

1)用胰蛋白酶-EDTA等回收HaLa细胞,制备细胞悬浊液。

2)离心分离细胞悬浊液(1000rpm, 3min)

3)除去上清,添加PBS(-)(此时细胞数为105 ~ 106cells /mL)

4)通过粘贴等充分分散。

*因为培养液中的血清等有使背景上升的危险重复②~④的操作充分清洗。

5)在1.5 mL微管中添加用4)得到的30μL细胞悬浊液。

6)在此加入15μL的FDA溶液。

7)盖上微管,37℃下孵育15min。

8)在玻璃罩上放上7)的溶液10μL,从上面再盖上一层玻璃,夹入染色的细胞悬浊液。

9)将盖杯置于荧光显微镜下,用490nm滤光器激发,观察发出黄绿色荧光的活细胞。

例2:C57BL/6小鼠脾脏细胞的双重染色,使用FDA和PI。

k.h.j ones, j.a. senft, J.Histochem.Cytochem., 33, 77 (1985).

将5mg的FDA溶解在1ml的丙酮中(储备溶液)

将上述0.04 mL溶液稀释为10ml PBS(-)。

PI将1mg溶解在50ml PBS(-)中。

在0.2 mL D-PBS溶液中混浊的细胞(2×106 cells/mL)溶液中添加0.1 mL的FDA溶液和0.03 mL的PI溶液。

孵化后观察。

【例3】使用HeLa细胞的细胞膜离子梯度对Fluorescein溶出的影响

·E.Prosperi, Histochem. J., 22, 227 (1990).

将5mg的FDA溶解在1ml的丙酮中(储备溶液)

用PBS(-),终浓度2.4μmol/L染色。

 

Q2:细胞染料的激发波长和发射波长是多少。

A2:

FDA试剂货号:F209 Fluorescein diacetate

日本同仁化学活细胞质染色-绿色——Calcein-AM货号:C326 CAS号:148504-34-1- DOJINDO

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活细胞质染色-绿色——Calcein-AM货号:C326
3′,6′-Di(O-acetyl)-4′,5′-bis[N,N-bis(carboxymethyl)aminomethyl]fluorescein, tetraacetoxymethyl ester
CAS号:148504-34-1
商品信息
储存条件:-20度保存
运输条件:室温
分子式:

C46H46N2O23

分子量:

994.86

特点:

 

● 活细胞和死细胞可同时染色

● 490 nm激发波长,515 nm发射波长

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产品文献
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1 mg

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细胞染色

活细胞质染色-绿色——Calcein-AM货号:C326 CAS号:148504-34-1

活细胞质染色-绿色——Calcein-AM货号:C326 CAS号:148504-34-1

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规格性状
产品概述
原理
产品特性
荧光特性
操作说明
参考文献
常见问题Q&A

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NO.1.    Cell Counting Kit-8     细胞增殖毒性检测

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NO.5.    Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit    细胞凋亡检测

 

规格性状

规格

 

特性:该产物为无色至微黄色固体,可溶于二甲基亚砜和乙腈。

可溶于二甲基亚砜:试验成功

NMR光谱:试验成功

产品概述

Calcein-AM是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂,由于它在Calcein的基础上加强了疏水性,因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后,酯酶会将其水解为Calcein留在细胞内,发出强绿色荧光。与其它同类试剂 (如BCECF-AM和Carboxy-fluorescein diacetate) 相比,Calcein-AM是最适合作为荧光探针去染活细胞的,因为它的细胞毒性很低。Calcein不会抑制任何的细胞功能如增殖或淋巴球的趋化性。使用了Calcein的活性检测的实验结果是十分可信并且与标准的51Cr-释放法所得结果相一致的。Calcein的激发和发射波长分别为490nm和515nm。

Calcein-AM可与PI结合使用,分别对活细胞和死细胞染色,可用于同时对活细胞和死细胞进行荧光染色。

*Caution* 

Please tap the tube before opening, and open it with care. The content may have relocated from the bottom of the tube during the shipping.

*警告*

打开前请先轻敲试管,并小心打开。 在运输过程中,内装物可能已从试管底部移开。

活细胞质染色-绿色——Calcein-AM货号:C326 CAS号:148504-34-1

原理

Fig. 1  Cell staining mechanism

活细胞质染色-绿色——Calcein-AM货号:C326 CAS号:148504-34-1

产品特性

钙黄绿素-AM通过钙黄绿素的四个羧基的乙酰氧基甲基酯化(AM转化)而使其可透过细胞膜。钙黄绿素-AM本身几乎不显示荧光,但通过细胞内酯酶水解变成钙黄绿素。该钙黄绿素是不透膜的化合物,表现出强的黄绿色荧光(λex= 490 nm,λem= 515 nm)。羧基荧光素二乙酸盐(CFDA)和荧光素二乙酸盐(FDA)与荧光素-AM具有相同的荧光素骨架,被称为染色活细胞的染料。但是,这些化合物在显色后容易从细胞膜泄漏,这已成为使用中的问题之一。与这些染料相比,钙黄绿素-AM越来越多地用作显色后从细胞泄漏较少的染料。还已知它不抑制细胞功能,例如淋巴细胞增殖和白细胞趋化性。另外,钙黄绿素-AM在利用杀伤性T细胞和NK细胞的细胞毒性活性的测定中,与使用广泛使用的放射性同位素的51Cr释放方法得到相同的结果,因此细胞毒性较小。钙黄绿素-AM对活细胞染色,并用于在荧光显微镜和流式细胞仪下观察,但是当与死细胞染色染料组合使用时,常用于活细胞和死细胞的双重荧光染色。Papadopoulus等人使用Calcein-AM和Ethidium homodimer(EthD-1)进行双重染色,并使用两种染料的荧光波长差异通过流式细胞术研究细胞毒性。钙黄绿素-AM目前是用于染色活细胞的最有用的染料,因为它的细胞毒性较小,荧光后细胞泄漏较少。如上所述,目前正在使用放射性同位素的测量方法,但是从安全性和便利性的角度出发,期望使用荧光化合物的细胞研究的分析将继续进行。

荧光特性

λex=490 nm, λem=515 nm

操作说明

1. 用1ml无水DMSO溶解1 mg Calcein-AM,制备成1 mmol/l的Calcein-AM母液,-20℃下密闭冷冻保存。

2. 用PBS将Calcein-AM母液稀释制成1-50 µM的Calcein-AM溶液(现配现用)。

3. 吸掉预培养好的细胞中的培养基,用合适的缓冲液清洗2-3次。a)

4. 加入适量的Calcein-AM溶液,在37℃培养细胞15-30分钟。

5. 用PBS或适当的缓冲液洗涤细胞两次。

6. 用490 nm激发波长,515 nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。

a) 如果Calcein-AM很难进入细胞,可以使用表面活性剂,如Pluronic® F127。

参考文献

1) K. McGinnes, G.Chapman, R.Marks and R.Penny, “A Fluorescence NK Assay Using Flow Cytometry”, J.Immunol.Methods,1986,86,7.

2) S.J.Morris,”Real-time Multi-wavelength Fluorescence Imaging of Living Cells”, BioTechniques,1990,8(3),296.

3) S.A.Weston and C.R.Parish,”New Fluorescent Dyes for Lymphocyte Migration Studies Analysis by Flow Cytometry and Fluorescent Microscopy”, J.Immunol.Methods,1990,133,87.

4) D.M.Callewaert,G.Radcliff,R.Waite,J.Lefevre and D.Poulik,”Characterization of Effector-Target Conjugates for Cloned Human Natural Killer and Human Lymphokine Activated Killer Cells by Flow Cytometry”,Cytometry,1991,12,666.

5) Han-Qing Xie, R.Huang and V.W.Hu, “Intercellular Communication Through Gap Junctions Is Reduced in Senescent Cell”, Biophys.J,1992,62,45.

6) S.A.Weston and C.R.Parish,”Calcein: a Novel Marker for Lymphocytes Which Enter Lymph Nodes”,Cytometry,1992,13,739.

7) X.M.Wang, P.I.Terasaki,G.W. Rankin Jr. ,D.Chia,H.P.Zhong and S.Hardy,”A New Microcellular Cytotoxicity Test Based on Calcein AM Release”, Hum. Immunol.,1993,37,264.

8) N.G.Papadopoulos,G.V.Dedoussis,G.Spanakos,A.D.Gritzapis, C.N.Baxevanis and M.Papamichail,”An Improved Fluorescence Assay for the Determination of Lymphocyte-Mediated Cytotoxicity Using Flow Cytometry”, J.Immunol.Methods,1994,177,101.

9) L.S.De Clerck,C.H.Bridts,A.M.Mertens,M.M.Moens and W.J.Stevens,”Use of Fluorescent Dyes in the Determination of Adherence of Human Leucocytes to Endothelial Cells and the Effects of Fluorochromes on Cellular Function”, J.Immunol. Methods,1994,172,115.

10) H.Ohata,Y.Ujiki and K.Momose,”Confocal Imaging Analysis of ATP-Induced Ca2+ Response in Individual Endothelial Cells of the Artery in Situ”, Am.J.Physiol. ,1997,272(6),1980.

常见问题Q&A

Q1:与51Cr释放方法有关吗
 

A1: “钙黄绿素-AM与51Cr释放方法之间存在相关性。

以下文件中有一份报告。N.G.Papadopoulos, et.al., J.Immunol.Methods, 177,101-111(1994)”

 

Q2:细胞染料的激发波长和发射波长是多少。

A2:

活细胞质染色-绿色——Calcein-AM货号:C326 CAS号:148504-34-1

 

Q3:细胞染色试剂Cellstain的哪些活细胞染色染料可以在细胞中长时间停留?

 

A3: “就细胞内保留而言,“ CFSE”可以在细胞中停留最长时间。尽管荧光强度降低,但是已经证实细胞中存在荧光染料达8周。用“ Calcein-AM”和“ BCECF-AM”观察到荧光达3天。也有报道称“钙蛋白-AM”在6小时内在细胞中保留了90%”

・S.A.Weston, et.al., J.Immunol.Methods, 133, 87-97(1990)

・H.P.Zhong, et.al., Hum.Immunol., 37, 264-270(1993)”

但是,“钙调蛋白-AM”和“ BCECF-AM”对细胞毒活性没有影响。

・L.S.D.Clerck, et.al., J.Immunol.Methods, 172, 115-124(1994)

还要注意的一点是,原始的基本骨架是荧光素,因此由于激发光而褪色由于容易发生,因此可能难以通过长期激发来观察荧光。

(尽管最好使用防褪色剂等)

Q4:如何使用Calcein-AM。
 

A4:下面以HeLa细胞的情况为例进行介绍。

根据细胞类型和观察条件考虑并固定试剂浓度。

【试剂】

溶液A:将1 mg钙黄绿素-AM溶于1 ml DMSO→1 mmol / L溶液

*将溶液存放在-20°C的阴凉处,以防止变质。

溶液B:用PBS(-)将溶液A稀释500倍(用5 mL PBS稀释10μl溶液A得到2μmol/ L)。

* Calcein-AM在水溶液中分解,因此在使用前请准备溶液B。

【操作】

1)用胰蛋白酶-EDTA收集HeLa细胞并制备细胞悬液。

2)离心细胞悬液(1,000 rpm,3分钟)

3)除去上清液并添加PBS(-)(此时,准备细胞数为105至106细胞/ mL)。

4)用移液器充分分散。

*由于培养液中的血清可能会升高背景,请执行操作2)至4)。

重复并彻底清洗。

5)将30μl在4)中获得的细胞悬液添加至1.5ml微管中。

6)向其中加入15μL[液体B]。

7)盖上微管并在37°C下孵育15分钟。

8)将10μL7)的溶液放在盖玻片上,从上方堆叠盖玻片,然后将染色的细胞悬液夹在中间。

9)将盖玻片放在荧光显微镜下,用490 nm的滤光片激发,观察发出黄绿色荧光的活细胞。

(对于滤光片,如果是490±10 nm,则可以观察到)

*排除血清和酚红,因为它们是背景。

*如果背景很高,请清洁它。

*在载玻片上培养的细胞可以用相同的方式染色和观察。

*有关使用PI的双重染色方法,请参阅方案“我要分别对活细胞和死细胞进行染色”。

 

Q5:我已经购买了钙黄绿素-AM(粉末),并希望将其制成溶液。 我该怎么办?

 

A5:溶于DMSO。

分子量几乎为1000,因此,如果将1 mg溶于1 mL DMSO,它将是1 mM的溶液。

请使用尽可能干燥的DMSO。

日本同仁化学Calcein-AM/PI细胞双染试剂盒货号:C542 活死细胞双染试剂盒- DOJINDO

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Calcein-AM/PI细胞双染试剂盒货号:C542
活死细胞双染试剂盒
Calcein-AM/PI Double Staining Kit
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储存条件:-20度保存
运输条件:室温

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细胞染色

Calcein-AM/PI细胞双染试剂盒货号:C542 活死细胞双染试剂盒

Calcein-AM/PI细胞双染试剂盒货号:C542 活死细胞双染试剂盒

产品解说
活动进行中
试剂盒内含
产品概述
荧光特性
染色例
最佳浓度摸索
操作步骤
注意事项
参考文献

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凑单关联产品TOP5

NO.1.    Cell Counting Kit-8     细胞增殖毒性检测   

NO.2.    Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit    细胞凋亡检测

NO.3.    FerroOrange    细胞亚铁离子检测

NO.4.    Liperfluo    细胞脂质过氧化物检测

NO.5.    ROS Assay Kit    活性氧检测

 

试剂盒内含

                                                                     500 次            3000 次

・Calcein-AM Reagent                             200 μg x 1        1 mg x 1

・PI Stock Solution (1.5 mmol/l)              200 μl x 1         1 ml x 1

・DMSO                                                    200 μl x 1         1 ml x 1

产品概述

Calcein-AM/PI细胞双染试剂盒内含两种染料:Calcein-AM和Propidium Iodide (PI)。这个试剂盒可在荧光显微镜下同时观察在同一个细胞培养皿中的活细胞和死细胞。Calcein-AM可透过细胞膜,通过活细胞内的酯酶作用脱去AM基团,产生的Calcein (钙黄绿素) 发出强绿色荧光,因此活细胞在荧光显微镜下可被检测到绿色荧光。另一方面PI可以通过受损的细胞膜进入到死细胞内并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光,因此死细胞会被检测到红色荧光。除了用荧光显微镜外,也有报道可以用流式细胞仪和荧光酶标仪来进行定量检测。

荧光特性

Calcein-AM : λex=490 nm , λem=515 nm

PI : λex=530 nm , λem=580 nm

染色例

                                                                           细胞染色实例

Calcein-AM/PI细胞双染试剂盒货号:C542 活死细胞双染试剂盒

(a)                                     (b)                                      (c)

a)  Calcein-AM染FTC细胞(活细胞单染)

b)  PI染HCT116细胞(死细胞单染)

c)  Calcein-AM、PI染MHD-1 细胞(活死细胞双染)

最佳浓度摸索

由于不同细胞种类、细胞浓度的染色条件不同,我们建议自行摸索一下Calcein-AM和PI的最适浓度。

Calcein-AM和PI的最佳浓度是根据不同的细胞种类而定,通过以下的操作,我们可以找到不同细胞染色试剂的最佳浓度:

1. 通过在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黄皂苷中培养10 min或通过在70%乙醇中培养30 min制备死细胞。

2. 用0.1-10 μM PI溶液染死细胞,以便找到仅针对细胞核染色而不对细胞质染色的PI浓度。

3. 用0.1-10 μM Calcein-AM溶液染死细胞,以便找到不对细胞质染色的Calcein-AM浓度,再以此浓度的Calcein-AM对活细胞染色以检验活细胞是否被染色。

操作步骤

以HeLa细胞为例

制备1 mmol/l的Calcein-AM储存液

【500 次】

将200 μl DMSO加入到含200 μg Calcein-AM粉末的管中,用移液器吹打溶解。

【3000 次】

将1 ml DMSO加入到含1 mg Calcein-AM粉末的管中,用移液器吹打溶解。

※Calcein-AM储存液需要避光,在-20℃密封保存。

 

制备染色工作液

将Calcein-AM储存液和PI储存液恢复至室温后使用。

在5 ml的PBS(-)中加入10 μl Calcein-AM储存液和15 μl PI储存液,混匀制成工作液。此时Calcein-AM的浓度为2 μmol/l,而PI的浓度为4.5 μmol/l。

 

染色步骤

1、 用Trypsin-EDTA消化细胞。

2、 通过离心收集细胞(1,000 rpm,3 min)。

3、 去除上清液,加入PBS(-)制备细胞悬液(105 – 106 cells/ml为宜)。

4、 重复步骤2和步骤3数次以消除培养基中的酯酶活性。

5、 取100 μl 染色工作液与200 μl 细胞悬液混合,在37℃培养15 min。

6、 在490±10 nm激发波长下同时观察黄绿色荧光的活细胞和红色荧光的死细胞。另外用545 nm激发波长单独观察死细胞。

注意事项

1、 由于本试剂盒中的Calcein-AM Reagent 粉末和PI Stock Solution量很少,有可能会粘在盖子或管壁上,开封前请先涡旋以使其振落下来。

2、 由于Calcein-AM储存液对潮气敏感,请在使用后密闭Calcein-AM储存液的盖子。如果不能一次用完,建议分装保存,例如分装成10 μl/管,用封口膜封口,并用铝箔纸包裹,放在一个密闭性能好的塑料袋中,并放入一包干燥剂,在≤-20℃密封避光保存。

3、 配制好的染色工作液请在当天使用。

4、 PI有疑似致癌性,使用前应注意以下几点:

1) 使用时请带好手套,口罩,防护眼镜等,不要接触到或呼吸到。

2) 当PI不慎接触到皮肤时,请立刻用大量的水冲洗。

3) 处理方法

清洗容器的清洗液和废液请按照实验室的有毒有害物质的处理方法进行处理,或按照以下方法处理:

・用UV照射的方法进行分解

・用次氯酸钠氧化分解后,进行中和处理

参考文献

1. A novel photothermally controlled multifunctional scaffold for clinical treatment of osteosarcoma and tissue regeneration,

Materials Today, 2020, doi.org/10.1016/j.mattod.2019.12.005

2. Mitochondria-Targeted Artificial “Nano-RBCs” for Amplified Synergistic Cancer Phototherapy by a Single NIR Irradiation,

Advanced Science, 2018, 5, 1800049

3. 4D-Printed Biodegradable and Remotely Controllable Shape Memory Occlusion Devices,

Advanced Functional Materials, 2019, 29(51), 1906569

4. Magnetic Hyperthermia-Synergistic H2O2 Self-Sufficient Catalytic Suppression of Osteosarcoma with Enhanced Bone-Re

generation Bioactivity by 3D-Printing Composite, Advanced Functional Materials, 2019, 1907071

5. A Substitution-Dependent Light-Up Fluorescence Probe for Selectively Detecting Fe3+ Ions and Its Cell Imaging Application,

Advanced Functional Materials, 2018, 28(35), 1802833

6. An Extendable Star-Like Nanoplatform for Functional and Anatomical Imaging-Guided Photothermal Oncotherapy,

ACS Nano, 2019, 13(4), 4379-4391

7. Near-Infrared Light-Triggered Sulfur Dioxide Gas Therapy of Cancer, ACS Nano, 2019, 13(2), 2103-2113

8. Nanoenzyme-Augmented Cancer Sonodynamic Therapy by Catalytic Tumor Oxygenation,

ACS Nano, 2018, 12(4), 3780-3795

9. Terrylenediimide-Based Intrinsic Theranostic Nanomedicines with High Photothermal Conversion Efficiency for Photoacoustic

Imaging-Guided Cancer Therapy, ACS Nano, 2017, 11(4), 3797-3805

10. Two-Dimensional Graphene Augments Nanosonosensitized Sonocatalytic Tumor, ACS Nano, 2017, 11(9), 9467-9480

11. Multifunctional Bismuth Selenide Nanocomposites for Anti-Tumor Thermo-Chemotherapy and Imaging,

ACS Nano, 2016, 10(1), 984-97

12. Molecular Responses of Human Lung Epithelial Cells to the Toxicity of Copper Oxide Nanoparticles Inferred from Whole

Genome Expression Analysis, ACS Nano, 2011, 5(12), 9326–9338

13. Living functional hydrogels generated by bioorthogonal cross-linking reactions of azidemodified cells with alkyne-modified

polymers, Nature Communications, 2018, 9, 2195

14. A strongly adhesive hemostatic hydrogel for the repair of arterial and heart bleeds,

Nature Communications, 2019, 10(1), 2060

15. Magnetic-responsive and targeted cancer nanotheranostics by PA/MR bimodal imaging-guided photothermally triggered

immunotherapy, Biomaterials, 2019, 219, 119370

16. Oriented collagen fiber membranes formed through counter-rotating extrusion and their application in tendon regeneration,

Biomaterials, 2019, 207, 61-75

17. Triple-functional polyetheretherketone surface with enhanced bacteriostasis and anti-inflammatory and osseointegrative

properties for implant application, Biomaterials, 2019, 212, 98-114

18. Ultrasmall Cu2-xS nanodots as photothermal-enhanced Fenton nanocatalysts for synergistic tumor therapy at NIR-II

biowindow, Biomaterials, 2019, 206, 101-114

19. Theranostic 2D ultrathin MnO2 nanosheets with fast responsibility to endogenous tumor microenvironment and exogenous

NIR irradiation, Biomaterials, 2018, 155, 54-63

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Proc. Natl. Acad. Sci., 2018, 115(10), E2477-E2486

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imaging and photothermal therapy/radiotherapy of cancer, NPG Asia Material, 2016, 8, e273

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Theranostics, 2018, 8(6), 1648-1664

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25. Synthesis and characterization of hierarchically macroporous and mesoporous CaO-MO-SiO2-P2O5(M=Mg,Zn,Sr) bioactive

glass scaffolds, Acta Biomaterialia, 2011, 7(10), 3638-3644

Invitrogen miRNA 分离试剂盒AM1561

Invitrogen miRNA 分离试剂盒

  • 产品型号:  AM1561
  • 简单描述
  • Invitrogen miRNA 分离试剂盒内容与储存• 30 mL miRNA 洗涤液 I(室温)• 50 mL 洗涤液 2/3(室温)• 80 个收集管(室温)• 40 个滤芯(室温)• 100 mL 裂解/结合缓冲液 (4°C)• 10 mL miRNA 匀浆添加剂 (4°C)• 1.4 mL 凝胶上样缓冲液 II (-20°C)
详细介绍

Invitrogen  miRNA 分离试剂盒

mirVana™ miRNA 分离试剂盒使用快速程序通过基于高效玻璃纤维过滤柱 (GFF) 的方法从组织和细胞中分离小 RNA。该方法可分离大小范围在千碱基至 10 mer 之间的总 RNA。每个试剂盒含有足量试剂和耗材,可用于40次总 RNA(包括小 RNA)分离,或20次单独大 RNA 和小 RNA 组分分离。ben酚必须单独购买。该试剂盒的特性包括:

•可高效分离总 RNA(含小 RNA)
• 可富集小 RNA(小于 200 nt),以提高下游分析的灵敏度
•简单的30分钟程序
•适用于 miRNA、siRNA、shRNA 和 snRNA 分析
• 几乎与所有细胞和组织类型兼容

高效回收小 RNA
当前的 RNA 纯化程序依赖于有机提取,然后是酒精沉淀或 GFF 或硅酸盐基质上核酸分子吸附。遗憾的是,前一种程序需要酒精沉淀,这较为耗时且不能高效回收小 RNA。后一程序通常会导致大量小 RNA 丢失。mirVana™ miRNA 分离试剂盒使用有机提取,然后在专用结合和洗涤条件下在 GFF 上进行纯化。因此,该试剂盒可从几乎所有细胞和组织类型中高效回收所有 RNA(从大 mRNA 和核糖体 RNA 至 10 mer)。mirVana™ miRNA 分离试剂盒可从由 102–107 个培养细胞或 0.5–250 mg 组织组成的样品中分离总 RNA(含小 RNA)。

富集小 RNA
尽管 mirVana™ miRNA 分离试剂盒可高效纯化所有大于 10 nt 的 RNA,但它也包括分离 RNA 组分的程序,特别是富集或消耗小 RNA 物质。通过 mirVana™ miRNA 分离试剂盒中随附的富集程序,可以高效地从较大的 RNA 物质中纯化 ∼200 nt 及更小的 RNA 分子。所得 RNA 制备液高度富集 miRNA、siRNA 和/或 snRNA。与相同测定方法与总 RNA 配合使用时相比,使用 mirVana™ miRNA 分离试剂盒程序进行的小 RNA 富集可在更少背景下进行更敏感的小 RNA 检测。



Invitrogen  miRNA 分离试剂盒


规格

分离技术
离心柱(玻璃纤维过滤柱), 有机提取
纯化时间
30 min。
洗脱体积
100 μL
样品类型
细菌, 细胞, 植物样品, 组织, 病毒样品, 酵母菌, Enzymatic Reactions
最终产品类型
总 RNA、转录组 RNA、siRNA、snRNA、微小 RNA
高通量能力
不兼容高通量应用(手动)
适用于(应用)
microRNA分析
数量
40 Preps
运输条件
室温
原始材料量
最多 250 mg 组织,最多 10^7 个细胞
产量
Cells: ≤16 μg RNA per 50,000 cells
Tissue: ≤160 μg per 5 mg

内容与储存

• 30 mL miRNA 洗涤液 I(室温)
• 50 mL 洗涤液 2/3(室温)
• 80 个收集管(室温)
• 40 个滤芯(室温)
• 100 mL 裂解/结合缓冲液 (4°C)
• 10 mL miRNA 匀浆添加剂 (4°C)
• 1.4 mL 凝胶上样缓冲液 II (-20°C)
• 5 mL 洗脱液(-20°C、4°C 或室温)


Invitrogen T7 体外转录试剂盒AM1344

Invitrogen T7 体外转录试剂盒

  • 产品型号:  AM1344
  • 简单描述
  • Invitrogen T7 体外转录试剂盒内容与储存T7 酶混合物、10X 反应缓冲液 2XNTP⁄CAP 溶液、GTP 溶液、pTRI-Xef、TURBO DNase、醋酸铵终止液、氯化锂沉淀溶液和凝胶上样缓冲液 II 均储存在 –20°C 下。可在任何温度下储存无核酸酶水。
详细介绍

Invitrogen T7 体外转录试剂盒

mMESSAGE mMACHINE™ 试剂盒设计用于体外合成大量的加帽 RNA。加帽 RNA 可模拟体内发现的大多数真核 mRNA,因为其在 5' 末端有一个 7-甲基鸟苷帽结构。mMESSAGE mMACHINE™ 试剂盒反应包括超高得率转录反应中的帽类似物 [m7G(5')ppp(5')G]。帽类似物仅作为转录本的第一个或 5' 末端 G 掺入,因为其结构使得无法在 RNA 分子中的其他位点将其掺入。

mMESSAGE mMACHINE™ 试剂盒工作原理
mMESSAGE mMACHINE™ 试剂盒有简化的反应形式,其中所有 4 种核糖核苷酸和帽类似物混合于单一溶液中。该溶液的帽类似物:GTP 比值为 4:1,这适用于尽可能提高 RNA 得率和加帽转录本比例。mMESSAGE mMACHINE™ 试剂盒适用于卵母细胞显微注射用加帽 RNA 常规合成、体外翻译、转染和其他应用。在存在高核苷酸浓度的情况下,通过优化 RNA 合成的反应条件来实现高得率。此外,合成的 RNA 不会被任何可能含有 RNase 抑制剂(酶混合物的组成部分)的污染性核糖核酸酶降解。

使用 mMESSAGE mMACHINE™ 试剂盒
在 20 µL 反应中,在 2 小时孵育期间,mMESSAGE mMACHINE™ 高得率加帽 RNA 转录将生成大量的加帽 RNA。该方法获得的得率为使用常规体外转录反应的 10–50 倍。帽类似物与 GTP 的比值已经过优化,能够在得率 (15–35 µg) 与加帽转录本的比例 (80%) 之间实现良好折衷。mMESSAGE mMACHINE™ 试剂盒还包含一份 LiCl 沉淀溶液,该溶液可高效分离来自加帽 RNA 的蛋白和未掺入的核苷酸(包括游离帽类似物),提高翻译效率。mMESSAGE mMACHINE™ 试剂盒仅针对与试剂盒中包含的聚合酶配合使用进行了优化。使用不同的聚合酶可能会导致得率低。mMESSAGE mMACHINE™ 试剂盒包含 25 次转录反应所需的所有缓冲液和试剂。使用试剂盒提供的对照模板(非洲蟾蜍延伸因子 1α,pTRI Xef),每次 mMESSAGE mMACHINE™ 反应将使用 T3 或 T7 RNA 聚合酶生成约 20–30 µg 的 RNA,或使用 SP6 RNA 聚合酶生成约 15–25 µg RNA。



Invitrogen T7 体外转录试剂盒


规格

最终产品类型
合成 mRNA, mRNA
产品规格
试剂盒
样品类型
mRNA, 合成 mRNA
适用于(应用)
In Vitro Transcription, synthetic mRNA, mRNA, transfection, LNPs, GENEart, linearized DNA plasmid, delivery, PCR products
反应次数
25 次反应
产品线
Ambion™、mMESSAGE mMACHINE™
产品类型
T7 体外转录试剂盒
数量
25 次反应
促进剂
T7
运输条件
干冰
产量
20-30 µg
原始材料
PCR 产物、线性化 DNA 质粒

内容与储存

T7 酶混合物、10X 反应缓冲液 2XNTP⁄CAP 溶液、GTP 溶液、pTRI-Xef、TURBO DNase、醋酸铵终止液、氯化锂沉淀溶液和凝胶上样缓冲液 II 均储存在 –20°C 下。可在任何温度下储存无核酸酶水。


sciencell动物星形胶质细胞培养基AM-a1831–

sciencell动物星形胶质细胞培养基AM-a

  • 产品型号:  1831
  • 简单描述
  • sciencell动物星形胶质细胞培养基AM-a英文名:Astrocyte Medium-animal货号:1831厂家:sciencell产地:美国现货供应
详细介绍

sciencell动物星形胶质细胞培养基AM-asciencell动物星形胶质细胞培养基AM-a

动物星形胶质细胞培养基包含500 ml基础培养基,10ml胎牛血清 (FBS, Cat. No. 0010), 5ml动物星形胶质细胞生长添加物(AGS-a, Cat. No. 1882) and和5 ml青霉素/链霉素溶液 (P/S, Cat. No.0503).

星形胶质细胞培养基-动物描述:      

 

        动物星形胶质细胞培养基是专门为正常动物(大鼠或小鼠)星形胶质细胞体外培养设计的zui适于其生长的培养基。经灭菌的液体培养基,包含必需和非必需氨基酸、维生素、有机和无机化合物、激素、生长因子、微量矿物质和低浓度胎牛血清(2%)。该培养基缓冲体系为重碳酸盐,在含5%CO2的细胞培养箱中平衡后pH值为7.4。该培养基的配方能够选择性的促进正常动物星形胶质细胞体外培养中的增殖和生长,并为其达到营养平衡状态提供数量上和质量上的保证。

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細胞内カルシウムイオン測定試薬 Fura 2-AM | CAS 108964-32-5 同仁化学研究所

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細胞内カルシウムイオン測定試薬 Fura 2-AM | CAS 108964-32-5 同仁化学研究所Fura 2-AM

04 細胞内蛍光プローブ

Fura 2-AM

細胞内カルシウムイオン測定試薬 Fura 2-AM | CAS 108964-32-5 同仁化学研究所

  • 細胞内蛍光プローブ

細胞内カルシウムイオン測定試薬

  • 製品コード
    F015  Fura 2-AM
  • CAS番号
    108964-32-5
  • 化学名
    1-[6-Amino-2-(5-carboxy-2-oxazolyl)-5-benzofuranyloxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid, pentaacetoxymethyl ester
  • 分子式・分子量
    C44H47N3O24=1001.85
容 量 メーカー希望
小売価格
富士フイルム
和光純薬
1 mg ¥37,200 341-08621
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  • プロトコル 細胞内カルシウムイオン測定試薬 Fura 2-AM | CAS 108964-32-5 同仁化学研究所
    細胞内カルシウムイオン測定試薬 Fura 2-AM | CAS 108964-32-5 同仁化学研究所

参考文献

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1) G. Grynkiewicz, M. Poenie and R. Y. Tsien, "A New Generation of Ca2+ Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties", J. Biol. Chem., 1985, 260, 3440.
2) D. A. Williams, K. E. Fogarty, R. Y. Tsien and F. S. Fay, "Calcium Gradients in Single Smooth Muscle Cells Revealed by the Digital Imaging Microscope Using Fura-2", Nature, 1985, 318, 558.
3) R. Y. Tsien, T. J. Rink and M. Poenie, "Measurement of Cytosolic Free Ca2+ in Individual Small Cells Using Fluorescence Microscopy with Dual Excitation Wavelengths", Cell Calcium, 1985, 6, 145.
4) D. A. Williams and F. S. Fay, "Intracellular Calibration of the Fluorescent Calcium Indicator Fura-2", Cell Calcium, 1990, 11, 75.
5) W. Almers and E. Neher, "The Ca Signal from Fura-2 Loaded Mast Cells Depends Strongly on the Method of Dye-loading", FEBS Lett., 1985, 192, 13.
6) G. H. R. Rao, J. D. Peller and J. G. White, "Measurement of Ionized Calcium in Blood Platelets with a New Generation Calcium Indicator", Biochem. Biophys. Res. Commun., 1985, 132, 652.
7) H. Ozaki, K. Sato, T. Satoh and H. Karaki, "Simultaneous Recordings of Calcium Signals and Mechanical Activity Using Fluorescent Dye Fura 2 in Isolated Strips of Vascular Smooth Muscle", Jpn. J. Pharmacol., 1987, 45, 429.
8) M. Mitsui, A. Abe, M. Tajimi and H. Karaki, "Leakage of the Fluorescent Ca2+ Indicator Fura-2 in Smooth Muscle", Jpn. J. Pharmacol., 1993, 61, 165.
9) 宮川厚夫, 牧野徹, 玉川彰, 尾崎一穂, "ビデオ画像処理を用いた蛍光性カルシウム指示薬Fura-2による細胞内遊離カルシウムイオン濃度分布の測定", 分析化学, 1989, 38, 643.

よくある質問

Q

細胞内カルシウム測定試薬は何種類かありますが、どのように選べばよいのでしょうか?

A

測定機器や測定波長などで選ばれることが多いようです。
製品名の後ろに[-AM]が付いているものは細胞膜透過型になります。
それぞれの試薬の特性は

【Fura 2】
・2励起1蛍光
  励起(λex= Ca:340 nm, Ca free:380 nm)、蛍光:λem=500 nm
・解離定数:224 nmol/L
・蛍光強度比での測定が出来るので、誤差要因の補正を行なうことが出来る。
=>細胞内Ca濃度の計算が行ない易い。
・最も多く使用されている。
・励起フィルターを切替えなくてはいけないので、切替え間のタイムロスがある。
 (機器の性能にもよる)

【Fluo 3】
・1励起1蛍光
  励起:λex=508 nm、蛍光:λem=527 nm
・解離定数:400 nmol/L
・励起波長が長波長側にあるので細胞に与える障害が少ない
 (NADH,NADPHの影響が出ない)
・Arレーザーによる励起装置が使用出来る。
・スライス標本には適さない
 (Fluo3がスライス表面の死んだ細胞に結合するのか、細胞外のカルシウム濃度を測定する)

【Fluo 4】
・1励起1蛍光
  励起:λex=495 nm、蛍光:λem=518 nm
・解離定数:360 nmol/L
・Fluo3よりも蛍光強度が強い。
・励起波長が長波長側にあるので細胞に与える障害が少ない
 (NADH,NADPHの影響が出ない)
・Arレーザーによる励起装置が使用出来る。
・Fluo3よりも細胞毒性がでやすい。

【Indo 1】
・1励起2蛍光
  励起:λex= 330 nm、蛍光(λem= Ca:410 nm, Ca free:485 nm)
・解離定数:250 nmol/L
・励起波長の切替えの必要がないので、非常に早い速度のCa濃度変化や心筋細胞の
 ような動きの試料も測定できる(但し、検出器は2台必要)

【Rhod 2】
・1励起1蛍光
  励起:λex=553 nm、蛍光:λem=576 nm
・解離定数:1.0 μmol/L
・励起波長が長波長側にあるので細胞に与える障害が少ない
 (NADH,NADPHの影響が出ない)
・Arレーザーによる励起装置が使用出来る。

【Quin 2】
・1励起1蛍光
  励起:λex=339 nm、蛍光:λem=492 nm
・解離定数:110 nmol/L
・一番最初に開発されたプローブ

Q

はじめて測定します。Ca2+プローブの原理や測定方法、トラブルシューティング法を分かり易く教えて下さい。

A

はじめて細胞内Ca2+測定をされる方を対象としたプロトコルを作成しております。
原理、Ca2+プローブの特徴、測定方法、トラブルシューティングの方法等を記載しておりますので、ご参照下さい。

下記リンクよりダウンロード可能です。

「はじめて細胞内Ca2+を測定する方へ -カスタマーサポート担当者の視点から-」

細胞内カルシウムイオン測定試薬 Fura 2-AM | CAS 108964-32-5 同仁化学研究所 細胞内カルシウムイオン測定試薬 Fura 2-AM | CAS 108964-32-5 同仁化学研究所

取扱条件

規格
性状: 本品は、黄色~橙黄色結晶性粉末または固体でジメチルスルホキシドに溶ける。
純度(HPLC): 98.0% 以上
蛍光スペクトル: 試験適合
NMRスペクトル: 試験適合
取扱条件
保存条件: 冷凍,遮光
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細胞内カルシウムイオン測定試薬 Fura 2-AM solution | CAS 108964-32-5(Fura 2-AM) 同仁化学研究所Fura 2-AM solution

04 細胞内蛍光プローブ

Fura 2-AM solution

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  • 細胞内蛍光プローブ

細胞内カルシウムイオン測定試薬

  • 製品コード
    F016  Fura 2-AM solution
  • CAS番号
    108964-32-5(Fura 2-AM)
  • 化学名
    1-[6-Amino-2-(5-carboxy-2-oxazolyl)-5-benzofuranyloxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid, pentaacetoxymethyl ester, DMSO solution
  • 分子式・分子量
    C44H47N3O24=1001.85
容 量 メーカー希望
小売価格
富士フイルム
和光純薬
1 ml ¥51,000 343-05401
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参考文献

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1) G. Grynkiewicz, M. Poenie and R. Y. Tsien, "A New Generation of Ca2+ Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties", J. Biol. Chem., 1985260, 3440.
2) D. A. Williams, K. E. Fogarty, R. Y. Tsien and F. S. Fay, "Calcium Gradients in Single Smooth Muscle Cells Revealed by the Digital Imaging Microscope Using Fura-2", Nature1985318, 558.
3) R. Y. Tsien, T. J. Rink and M. Poenie, "Measurement of Cytosolic Free Ca2+ in Individual Small Cells Using Fluorescence Microscopy with Dual Excitation Wavelengths", Cell Calcium19856, 145.
4) D. A. Williams and F. S. Fay, "Intracellular Calibration of the Fluorescent Calcium Indicator Fura-2", Cell Calcium, 199011, 75.
5) W. Almers and E. Neher, "The Ca Signal from Fura-2 Loaded Mast Cells Depends Strongly on the Method of Dye-loading", FEBS Lett., 1985192, 13.
6) G. H. R. Rao, J. D. Peller and J. G. White, "Measurement of Ionized Calcium in Blood Platelets with a New Generation Calcium Indicator", Biochem. Biophys. Res. Commun.1985, 132, 652.
7) H. Ozaki, K. Sato, T. Satoh and H. Karaki, "Simultaneous Recordings of Calcium Signals and Mechanical Activity Using Fluorescent Dye Fura 2 in Isolated Strips of Vascular Smooth Muscle", Jpn. J. Pharmacol.198745, 429.
8) M. Mitsui, A. Abe, M. Tajimi and H. Karaki, "Leakage of the Fluorescent Ca2+ Indicator Fura-2 in Smooth Muscle", Jpn. J. Pharmacol.199361, 165.
9) 宮川厚夫, 牧野徹, 玉川彰, 尾崎一穂, "ビデオ画像処理を用いた蛍光性カルシウム指示薬Fura-2による細胞内遊離カルシウムイオン濃度分布の測定", 分析化学, 198938, 643.

よくある質問

Q

はじめて測定します。Ca2+プローブの原理や測定方法、トラブルシューティング法を分かり易く教えて下さい。

A

はじめて細胞内Ca2+測定をされる方を対象としたプロトコルを作成しております。
原理、Ca2+プローブの特徴、測定方法、トラブルシューティングの方法等を記載しておりますので、ご参照下さい。

下記リンクよりダウンロード可能です。

「はじめて細胞内Ca2+を測定する方へ -カスタマーサポート担当者の視点から-」

細胞内カルシウムイオン測定試薬 Fura 2-AM solution | CAS 108964-32-5(Fura 2-AM) 同仁化学研究所 細胞内カルシウムイオン測定試薬 Fura 2-AM solution | CAS 108964-32-5(Fura 2-AM) 同仁化学研究所

取扱条件

規格
性状: 本品は、黄色液体である。
純度(HPLC): 98.0% 以上
蛍光スペクトル: 試験適合
取扱条件
保存条件: 冷凍,遮光
危険・有害
シンボルマーク
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04 細胞内蛍光プローブ

Fluo 3-AM

細胞内カルシウムイオン測定試薬 Fluo 3-AM | CAS 121714-22-5 同仁化学研究所

  • 細胞内蛍光プローブ

細胞内カルシウムイオン測定試薬

  • 製品コード
    F023  Fluo 3-AM
  • CAS番号
    121714-22-5
  • 化学名
    1-[2-Amino-5-(2,7-dichloro-6-acetoxymethoxy-3-oxo-9-xanthenyl)phenoxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid,tetra(acetoxymethyl)ester
  • 分子式・分子量
    C51H50Cl2N2O23=1129.85
容 量 メーカー希望
小売価格
富士フイルム
和光純薬
1 mg ¥43,300 343-08061
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技術情報

溶解例

1 mg/0.5 mL(アセトニトリル)、1 mg/mL(ジメチルスルホキシド)

参考文献

参考文献を表示する

1) A. Minta, J. P. Y. Kao and R. Y. Tsien, "Fluorescent Indicators for Cytosolic Calcium Based on Rhodamine and Fluorescein Chromophores", J. Biol. Chem.1989264(14), 8171.
2) J. P. Kao, A. T. Harootunian and R. Y. Tsien, "Photochemically Generated Cytosolic Calcium Pulses and Their Detection by Fluo-3", J. Biol. Chem.1989264, 8179.
3) M. Eberhard and P. Erne, "Kinetics of Calcium Binding to Fluo-3 by Stopped-Flow Fluorescence", Biochem. Biophys. Res. Commun.1989163, 309.
4) A. Hernandez-Cruz, F. Sala and P. R. Adams, "Subcellular Calcium Transients Visualized by Confocal Microscopy in a Voltage-clamped Vertebrate Neuron", Science1990247, 858.
5) A. H. Cornell-Bell, S. M. Finkbeiner, M. S. Cooper and S. J. Smith, "Glutamate Induces Calcium Waves in Cultured Astrocytes: Long-Range Glial Signaling", Science1990247, 470.
6) D. A. Williams, "Quantitative Intracellular Calcium Imaging with Laser-scanning Confocal Microscopy", Cell Calcium199011, 589.
7) D. A. Williams, S. H. Cody, C. A. Gehring, R. W. Parish and P. J. Harris, "Confocal Imaging of Ionised Calcium in Living Plant Cells", Cell Calcium1990, 11, 291.
8) P. A. Vandenberghe and J. L. Ceuppens, "Flow Cytometric Measurement of Cytoplasmic Free Calcium in Human Peripheral Blood T Lymphocytes with Fluo-3, A New Fluorescent Calcium Indicator", J. Immunol. Methods1990127, 197.
9) 河内秀幸, 南川哲寛, 高松哲郎, "高速走査共焦点レーザ顕微鏡による心室筋対細胞間のカルシウム波伝播の解析", 心筋の構造と代謝, 199113, 63.
10) M. Iino, H. Kasai and T. Yamazawa, "Visualization of Neural Control of Intracellular Ca2+ Concentration in Single Vascular Smooth Muscle Cells in situ", EMBO J.199413 (21), 5026.
11) M. E. Dailey and S. J. Smith, "Spontaneous Ca2+ Transients in Developing Hippocampal Pyramidal Cells", J. Neurobiol.199425(3), 243.
12) M. Burnier, G. Centeno, E. Burki and H. R. Brunner, "Confocal Microscopy to Analyze Cytosolic and Nuclear Calcium in Cultured Vascular Cells", Am. J. Physiol.1994266, C1118.
13) E. Donnadieu and L. Y. W. Bourguignon, "Ca2+ Signaling in Endothelial Cells Stimulated by Bradykinin: Ca2+ Measurement in the Mitochondria and the Cytosol by Confocal Microscopy", Cell Calcium199620 (1), 53.
14) M. Ikeda, H. Ariyoshi, J. Kambayashi, K. Fujitani, N. Shinoki, M. Sakon, T. Kawasaki and M. Monden, "Separate Analysis of Nuclear and Cytosolic Ca2+ Concentrations in Human Umbilical Vein Endothelial Cells", J. Cell. Biochem.199663 (1), 23.
15) J. E. Merritt, S. A. McCarthy, M. P. A. Davies and K. E. Moores, "Use of fluo-3 to Measure Cytosolic Ca2+ in Platelets and Neutrophils Loading Cells with the Dye, Calibration of Traces, Measurements in the Presence of Plasma, and Buffering of Cytosolic Ca2+", Biochem. J.1990269, 513.

よくある質問

Q

細胞内カルシウム測定試薬は何種類かありますが、どのように選べばよいのでしょうか?

A

測定機器や測定波長などで選ばれることが多いようです。
製品名の後ろに[-AM]が付いているものは細胞膜透過型になります。
それぞれの試薬の特性は

【Fura 2】
・2励起1蛍光
  励起(λex= Ca:340 nm, Ca free:380 nm)、蛍光:λem=500 nm
・解離定数:224 nmol/L
・蛍光強度比での測定が出来るので、誤差要因の補正を行なうことが出来る。
=>細胞内Ca濃度の計算が行ない易い。
・最も多く使用されている。
・励起フィルターを切替えなくてはいけないので、切替え間のタイムロスがある。
 (機器の性能にもよる)

【Fluo 3】
・1励起1蛍光
  励起:λex=508 nm、蛍光:λem=527 nm
・解離定数:400 nmol/L
・励起波長が長波長側にあるので細胞に与える障害が少ない
 (NADH,NADPHの影響が出ない)
・Arレーザーによる励起装置が使用出来る。
・スライス標本には適さない
 (Fluo3がスライス表面の死んだ細胞に結合するのか、細胞外のカルシウム濃度を測定する)

【Fluo 4】
・1励起1蛍光
  励起:λex=495 nm、蛍光:λem=518 nm
・解離定数:360 nmol/L
・Fluo3よりも蛍光強度が強い。
・励起波長が長波長側にあるので細胞に与える障害が少ない
 (NADH,NADPHの影響が出ない)
・Arレーザーによる励起装置が使用出来る。
・Fluo3よりも細胞毒性がでやすい。

【Indo 1】
・1励起2蛍光
  励起:λex= 330 nm、蛍光(λem= Ca:410 nm, Ca free:485 nm)
・解離定数:250 nmol/L
・励起波長の切替えの必要がないので、非常に早い速度のCa濃度変化や心筋細胞の
 ような動きの試料も測定できる(但し、検出器は2台必要)

【Rhod 2】
・1励起1蛍光
  励起:λex=553 nm、蛍光:λem=576 nm
・解離定数:1.0 μmol/L
・励起波長が長波長側にあるので細胞に与える障害が少ない
 (NADH,NADPHの影響が出ない)
・Arレーザーによる励起装置が使用出来る。

【Quin 2】
・1励起1蛍光
  励起:λex=339 nm、蛍光:λem=492 nm
・解離定数:110 nmol/L
・一番最初に開発されたプローブ

Q

はじめて測定します。Ca2+プローブの原理や測定方法、トラブルシューティング法を分かり易く教えて下さい。

A

はじめて細胞内Ca2+測定をされる方を対象としたプロトコルを作成しております。
原理、Ca2+プローブの特徴、測定方法、トラブルシューティングの方法等を記載しておりますので、ご参照下さい。

下記リンクよりダウンロード可能です。

「はじめて細胞内Ca2+を測定する方へ -カスタマーサポート担当者の視点から-」

Q

Caの変化をフローサイトメトリーで測定したいと思っています。 どの試薬を使えばよいでしょうか?

A

フローサイトメトリーでは、励起波長が固定されておりますので、1波長励起タイプのものが望ましいと思われます。

まず、Indo 1(UV laser, 365 nm)やFluo 3(Ar-laser, 488 nm)をお試しください。
・Indo 1はカルシウムの結合によって蛍光波長が変化するメリットがあります。
・Fluo 3は励起光源としてArレーザーを利用できます。

実際の使用例としては、
[Indo 1]
 P. S. Rabinovitch, et al., Journal of Immunology, 137, 952 (1986).
[Fluo 3]
 S. W. Sherwood and Robert T. Schimke, Methods Cell Biol., 46, 77 (1995).
がございます。ご参照ください。

細胞内カルシウムイオン測定試薬 Fluo 3-AM | CAS 121714-22-5 同仁化学研究所 細胞内カルシウムイオン測定試薬 Fluo 3-AM | CAS 121714-22-5 同仁化学研究所

取扱条件

規格
性状: 本品は、赤色粉末又は固体で、ジメチルスルホキシド及びアセトニトリルに溶ける。
純度(HPLC): 85.0% 以上
アセトニトリル溶状: 試験適合
蛍光スペクトル: 試験適合
NMRスペクトル: 試験適合
取扱条件
保存条件: 冷凍,遮光
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