日本同仁化学-SulfoBiotics- Sodium disulfide (Na2S2)货号：SB02 CAS号：22868-13-9- DOJINDO

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-SulfoBiotics- Sodium disulfide (Na2S2)货号：SB02

Sodium disulfide, anhydrous

CAS号：22868-13-9

商品信息

储存条件：4度

运输条件：常温运输

分子量：

110.11

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SDS

选择规格：

100mg*5

现货

硫化氢检测

规格性状

产品概述

生物体内存在含硫烷硫分子的种类

Sodium polysulfide的构造

参考文献

规格性状

规格：100 mg× 5

性状：本产品是黄色~黄褐色固体粉末

纯度：90.0%以上

保存条件：避光冷藏；操作时注意防止吸湿

产品概述

最近的研究发现，过硫化物(Persulfide)和多硫化物(Polysulfide)等硫烷硫(Sulfane Sulfur)是生物体内的一种新型信号分子。这一类活性硫烷硫分子可以通过硫化氢释放和储存，并且与蛋白质的硫醇(Thiol)为目标的一系列信号传递(如蛋白质的巯基化等)密切相关，因此受到了广泛关注。不仅如此，过硫化物和多硫化物的还原性甚至高于半胱氨酸(Cysteine)和谷胱甘肽(Glutathione)等生物体内常见的具有还原性的物质，对维持体内的氧化还原平衡也非常重要。

Sodium polysulfide (Na2Sn)是诸多硫烷硫供体中结构最简单的一种，它在水溶液中可以随着pH的变化生成拥有多种结构的多硫化氢(Hydrogen Polysulfide, H2Sn, n≥2)。本产品是专门用于研究过硫化物、多硫化物等活性硫烷硫分子在生物体内相关通路中作用的试剂。

生物体内存在含硫烷硫分子的种类

-SulfoBiotics- Sodium disulfide (Na2S2)货号：SB02 CAS号：22868-13-9

※生物体内含有硫烷硫的分子种类会随氧化还原而发生变化。

Sodium polysulfide的构造

供体	Sodium disulfide(Na₂S)	Sodium trisukfide(Na₂S₃)	Sodium tetrasulfide(Na₂S₄)
构造	Na^+-S-S^–Na⁺	Na^+-S^-S-S-Na⁺	Na^+-S^-S-S^–Na⁺
PKa₁	5	4.2	3.8
pKa₂	9.7	7.5	6.3
货号	SB02	SB03	SB04

※pKa值请参考下面文献：

J. Gun et al., “Electrospray Ionization Mass Spectrometric Analysis of Aqueous Polysulfide Solutions”, Microchim. Acta, 2004, 146, 229

参考文献

1) Y. Kimura, Y. Mikami, K. Osumi, M. Tsugane, J. Oka, and H. Kimura, “Polysulfides are possible H2S-derived signaling molecules in rat brain”, FASEB J., 2013, 27, 2451.
2) S. Koike, Y. Ogasawara, N. Shibuya, H. Kimura, and K. Ishii, “Polysulfide exerts a protective effect against cytotoxicity caused by t-buthylhydroperoxide through Nrf2 signaling in neuroblastoma cells”, FEBS Lett., 2013, 587, 3548.
3) E. R. DeLeon, Y. Gao, E. Huang, M. Arif, N. Arora, A. Divietro, S. Patel, and K. R. Olson , “A case of mistaken identity: are reactive oxygen species actually reactive sulfide species?”, American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology ., 2015, 310, (7), 549.
4) D. Delgermuruna, S. Yamaguchia, O. Ichiib, Y. Konb, S. Itoa, and K. Otsuguroa, “Hydrogen sulfide activates TRPA1 and releases 5-HT from epithelioid cells of the chicken thoracic aorta”, Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology., 2016, 187, 43 .
5) S. Koikea, T. Kayamaa, S. Yamamotoa, D. Kominea, R. Tanakaa, S. Nishimotoa, T. Suzukia, A. Kishidab, and Y. Ogasawaraa, “Polysulfides protect SH-SY5Y cells from methylglyoxal-induced toxicity by suppressing protein carbonylation: A possible physiological scavenger for carbonyl stress in the brain”, NeuroToxicology., 2016,55, 13 .

日本同仁化学SulfoBiotics- SSP4试剂货号：SB10- DOJINDO

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SulfoBiotics- SSP4试剂货号：SB10

3′,6′-Di(O-thiosalicyl)fluorescein

SulfoBiotics- SSP4

商品信息

储存条件：-20度保存，避光

运输条件：室温

分子式：

C₃₄H₂₀O₇S₂

分子量：

604.65

特点：

● 荧光背景低

● 灵敏度高

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产品文献

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选择规格：

1mg

期货

硫化氢

日本同仁化学SulfoBiotics- HSip-1 DA试剂货号：SB22 CAS号：1346170-03-3(free base)- DOJINDO

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SulfoBiotics- HSip-1 DA试剂货号：SB22

N-[3′,6′-Bis(acetyloxy)-3-oxo-3H-spiro(isobenzofuran-1,9′-xanthen)-5-yl]-(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1-acetamide-κN1,κN4,κN7,κN10copper(2+)sulfate

CAS号：1346170-03-3(free base)

商品信息

储存条件：0-5度保存

运输条件：室温

分子式：

C₃₄H₃₇CuN₅O₁₂S

分子量：

803.29

特点：

● 检测细胞内H2S

● 灵敏度高

● 特异性强

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宣传资料

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选择规格：

50μg

期货

硫化氢

SulfoBiotics- HSip-1 DA试剂货号：SB22 CAS号：1346170-03-3(free base)

产品性状

产品概述

原理

溶液配制

荧光参数

实验案例

参考文献

产品性状

规格

性状：本品为蓝色固体

纯度（HPLC）： 90%以上

荧光光谱：符合实验要求

处理条件

保存方法： 0~5°C

产品概述

硫化氢 (H₂S) 在舒张血管，保护细胞和调节胰岛素分泌方面具有重要的生理作用已经得到广泛的认可。 H₂S被认为是一种类似于NO和CO的气体信号分子，但在生理条件下大约80％的H₂S是以HS^–的状态存在的 (pKa=7)。HS^– 很容易转变为各种过硫化物和多硫化物。 -SulfoBiotics- HSip-1 是一种新的特异性检测H₂S的荧光探针，当和H₂S反应时会发出较强的绿色荧光。 -SulfoBiotics- HSip-1 DA可以穿透细胞膜检测细胞内的H₂S。

原理

硫化氢 (H₂S) 在舒张血管，保护细胞和调节胰岛素分泌方面具有重要的生理作用已经得到广泛的认可。H₂S被认为是一种类似于NO和CO的气体信号分子，但在生理条件下大约80％的H₂S是以HS^–的状态存在的(pKa=7)。HS^–很容易转变为各种过硫化物和多硫化物。

-SulfoBiotics- HSip-1 是一种新的特异性检测H₂S的荧光探针，当和H₂S反应时会发出较强的绿色荧光。

-SulfoBiotics- HSip-1 DA可以穿透细胞膜检测细胞内的H₂S。

溶液配制

制备1 mmol/l HSip-1 DA储存液

加53 ul DMSO至含有50 ug HSip-1 DA的管子中，用移液器吹打溶解。

*配制好的溶液请在-20℃保存，可以保存1个月

荧光参数

E x：470 ～ 500 nm

Em：500 ～ 550 nm

SulfoBiotics- HSip-1 DA试剂货号：SB22 CAS号：1346170-03-3(free base)

实验案例

用HSip-1 DA检测硫化氢的荧光成像

1. 在 u-slide 8孔板 (ibidi)中接种HeLa细胞，并在37℃,5%的CO₂培养箱中过夜培养。

2. 更换培养基，用无血清的MEM培养基清洗细胞2次。

3. 用无血清的MEM培养基稀释1 mmol/l 的HSip-1 DA储存液，制成5 umol/l 的HSip-1 DA工作液。

* 请根据细胞种类优化HSip-1 DA的终浓度。

4. 在细胞中加入200 ul 5 umol/l的 HSip-1 DA工作液，并在37℃ 5%的CO₂培养箱中培养30 min。

5. 去除上清液，用HBSS清洗细胞2次。

6. 在每孔中加入200 ul 200 umol/l 的Na2S溶液，并在37℃ 5%的CO₂培养箱中培养30 min。

7. 去除上清液，用HBSS清洗细胞2次。

8. 加入200 ul HBSS，用共聚焦荧光显微镜观察细胞。

用HSip-1 DA检测HeLa细胞 (经过Na₂S处理) 中的硫化氢

(A: Control, B: 用200 umol/l Na₂S 处理)

SulfoBiotics- HSip-1 DA试剂货号：SB22 CAS号：1346170-03-3(free base)

参考文献

1) Sasakura, et al., Development of a Highly Selective Fluorescence Probe for Hydrogen Sulfide,J. Am. Chem. Soc., 2011, 133, 18003-18005

2) Kenjiro Hanaoka, et al., Discovery and Mechanistic Characterization of Selective Inhibitors of H2Sproducing Enzyme: 3-Mercaptopyruvate Sulfurtransferase (3MST) Targeting Active-site Cysteine Persulfide, Scientific Reports, 2017, 7, 40227

日本同仁化学SulfoBiotics- HSip-1试剂货号：SB21 CAS号：1346220-52-7(free base)- DOJINDO

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SulfoBiotics- HSip-1试剂货号：SB21

N-[3′,6′-Dihydroxy-3-oxo-3H-spiro(isobenzofuran-1,9′-xanthen)-5-yl]-(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1-acetamide-κN1, κN4, κN7, κN10) copper(2+) sulfate

CAS号：1346220-52-7(free base)

商品信息

储存条件：在冷暗处保存

运输条件：室温

分子式：

C₃₀H₃₃CuN₅O₁₀S

分子量：

719.22

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选择规格：

1mg

期货

硫化氢

SulfoBiotics- HSip-1试剂货号：SB21 CAS号：1346220-52-7(free base)

产品性状

产品概述

检测原理

溶解比例

荧光参数

实验案例

产品性状

规格：

性状：本品为褐色固体

纯度（HPLC）： 90%以上

处理条件

保存方法： 0~5°C

产品概述

硫化氢 (H₂S) 在舒张血管，保护细胞和调节胰岛素分泌方面具有重要的生理作用已经得到广泛的认可。 H₂S被认为是一种类似于NO和CO的气体信号分子，但在生理条件下大约80％的H₂S是以HS-的状态存在的 (pKa=7)。HS- 很容易转变为各种过硫化物和多硫化物。 -SulfoBiotics- HSip-1 是一种新的特异性检测H₂S的荧光探针，当和H2S反应时会发出较强的绿色荧光。 -SulfoBiotics- HSip-1 DA可以穿透细胞膜检测细胞内的H₂S。

检测原理

硫化氢 (H₂S) 在舒张血管，保护细胞和调节胰岛素分泌方面具有重要的生理作用已经得到广泛的认可。

H₂S被认为是一种类似于NO和CO的气体信号分子，但在生理条件下大约80％的H₂S是以HS^–的状态存在的(pKa=7)。

HS-很容易转变为各种过硫化物和多硫化物。

-SulfoBiotics- HSip-1 是一种新的特异性检测H₂S的荧光探针，当和H₂S反应时会发出较强的绿色荧光。

-SulfoBiotics- HSip-1 DA可以穿透细胞膜检测细胞内的H₂S。

溶解比例

制备10 mmol/l HSip-1储存液，加117 ul超纯水至含有1 mg HSip-1的管子中，用移液器吹打溶解。

*配制好的溶液请在-20℃保存，可以保存1个月。

荧光参数

Ex： 470 ～ 500 nm

Em：500 ～ 550 nm

SulfoBiotics- HSip-1试剂货号：SB21 CAS号：1346220-52-7(free base)

实验案例

一. 用HSip-1检测硫化氢

1. 用PBS稀释10 mmol/l HSip-1储存液，制成200 umol/l的 HSip-1工作液。

2. 用1 ml 充氮处理过的超纯水溶解7.8 mg Na₂S制成 100 mmol/l Na₂S溶液。

3. 吸取20 ul 100 mmol/l 的Na₂S溶液至980 ul超纯水中，制成2 mmol/l 的Na₂S溶液。

4. 吸取100 ul 2 mmol/l 的Na₂S溶液至900 ul超纯水中，制成200 umol/l 的Na₂S溶液。

5. 用超纯水稀释200 umol/l 的Na₂S溶液，制成一个系列浓度的 (200 umol/l, 100 umol/l,

50 umol/l, 25 umol/l, 12.5 umol/l, 6.3 umol/l, 3.2 umol/l, 0 umol/l) 的Na₂S标准溶液。

6. 吸取350 ul 200 umol/l的 HSip-1工作液至300 ul的Na₂S溶液中，并用涡旋振荡器振荡混匀。

7. 上述溶液在室温培养30 min后，转移至96孔板中 (200 ul/孔)。

8. 用荧光酶标仪测定在516 nm (ex=491 nm)的荧光强度。

日本同仁化学SulfoBiotics- GYY4137试剂货号：SB06 CAS号：106740-09-4- DOJINDO

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SulfoBiotics- GYY4137试剂货号：SB06

(4-Methoxyphenyl)morpholinylphosphinodithioic acid, morpholine salt

CAS号：106740-09-4

商品信息

储存条件：0-5度保存

运输条件：室温

分子式：

C₁₅H₂₅N₂O₃PS₂

分子量：

376.47

特点：

● 缓慢释放H2S的供体

● 水溶性好

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选择规格：

10mg

期货

日本同仁化学SulfoBiotics- Sulfide dibimane试剂货号：SB15 CAS号：1392113-30-2- DOJINDO

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SulfoBiotics- Sulfide dibimane试剂货号：SB15

Bis(2,5,6-trimethylpyrazolo[1,2-a]pyrazole-1,7-dione-3-ylmethyl)sulfide

CAS号：1392113-30-2

商品信息

储存条件：0-5度保存

运输条件：室温

分子式：

C₂₀H₂₂N₄O₄S

分子量：

414.48

特点：

● HPLC的方法检测H₂S

● 灵敏度高

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选择规格：

10 nmol*5

期货

硫化氢

SulfoBiotics- Sulfide dibimane试剂货号：SB15 CAS号：1392113-30-2

产品性状

产品概述

检测原理

实验案例

文献

产品性状

规格

性状：本品为无色或淡黄色固体

纯度（HPLC）： 97%以上

含量： 0.540~0.600（370nm）

处理条件

保存方法：避光冷藏

产品概述

硫化氢 (H₂S) 在舒张血管，保护细胞和调节胰岛素分泌方面具有重要的生理作用已经得到广泛的认可。H₂S被认为是一种除了NO和CO以外的第三种气体信号分子，在生理状态下大约80％的硫化氢解离为HS^–(pKa=7.0)。Monobromobimane (简称mBBr) 法是硫化氢检测最灵敏和可靠的方法之一。1个分子的H₂S可以与2个分子的mBBr反应生成1个分子的Sulfide dibimane.采用高效液相色谱法 (HPLC)可以分析谷胱甘肽或半胱氨酸和mBBr反应生成的Sulfide dibimane，由于它可以发出荧光，所以检测的灵敏度较高1),2),3)。

检测原理

硫化氢 (H₂S) 在舒张血管，保护细胞和调节胰岛素分泌方面具有重要的生理作用已经得到广泛的认可。H₂S被认为是一种除了NO和CO以外的第三种气体信号分子，在生理状态下大约80％的硫化氢解离为HS^–(pKa=7.0)。Monobromobimane (简称mBBr) 法是硫化氢检测最灵敏和可靠的方法之一。1个分子的H₂S可以与2个分子的mBBr反应生成1个分子的Sulfide dibimane 。采用高效液相色谱法 (HPLC)可以分析谷胱甘肽或半胱氨酸和mBBr反应生成的Sulfide dibimane，由于它可以发出荧光，所以检测的灵敏度较高。

SulfoBiotics- Sulfide dibimane试剂货号：SB15 CAS号：1392113-30-2

实验案例

HPLC实验例

样品的预处理

1. 吸取30 ul样品至含有70 ul 100 mmol/l Tris-HCl缓冲液 (pH 9.5,0.1 mmol/l DTPA) 的管子中。

2. 加入50 ul 10 mmol/l的mBBr乙腈溶液。

3. 培养30 min。

4. 加入50 ul 200 mmol/l的 5-磺基水杨酸。

5. 取上清液作为检测样品。

* 有关mBBr法的详细情况，请参见Methods Enzymol.，2015，554，314)。

硫化氢的定量分析

6. 加入100 ul乙腈至含有10 nmol Sulfide dibimane的管子中，用移液器吹打使溶解，制成0.1 mmol/l 的Sulfide dibimane储存液。

7. 用乙腈稀释0.1 mmol/l Sulfide dibimane储存液，稀释成一个系列浓度梯度的溶液。

8. 吸取上述系列浓度梯度的溶液各5 ul注射入HPLC色谱柱，制成一条标准曲线 (下图)。

9. 通过HPLC分析样品，计算Sulfide dibimane的峰面积。

10. 用标准曲线计算样品中HS^–的浓度。

注意：Sulfide dibimane溶液对光敏感，请避光并在一天内用完。

＜HPLC条件＞

柱：Inersil ODS-3

流动相：A) 0.1% TFA/H₂O ，

B) 0.1% TFA/Acetonitrile (TFA: Trifluoroacetic acid) B conc.：

5%-35% (0-5 min)，

35%-55% (5-16 min)，

55%-70% (16-23 min)

检测：荧光 (Ex: 390 nm, Em: 475 nm)

流速：1 ml/min

柱温：40℃

SulfoBiotics- Sulfide dibimane试剂货号：SB15 CAS号：1392113-30-2

文献

1) G. L. Newton, R. Dorian and R. C. Fahey,Anal. Biochem., 1981, 114, 383.

2) E. A. Wintner, T. L. Deckwerth, W. Langston, A.Bengtsson, D. Leviten, P. Hill, M. A. Insko, R.Dumpit,E.Vanden Ekart, C. F. Toombs and C. Szabo,Br. J. Pharmacology, 2010, 160, 941.

3) X. Shen, C. B. Pattillo, S. Pardue, S. C. Bir, R.Wang and C. G. Kevil,Free Radic. Biol. Med., 2011, 50, 1021

关联产品

日本同仁化学SulfoBiotics- PEG-PCMal试剂货号：SB20 蛋白质巯基标记试剂- DOJINDO

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SulfoBiotics- PEG-PCMal试剂货号：SB20

蛋白质巯基标记试剂

SulfoBiotics- PEG-PCMal

商品信息

储存条件：0-5度保存

运输条件：室温

分子量：

2736.19

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选择规格：

1mg

价格：

期货

硫化氢

日本同仁化学DAB试剂货号：D006 3,3′-Diaminobenzidine, tetrahydrochloride CAS号：7411-49-6- DOJINDO

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DAB试剂货号：D006

3,3′-Diaminobenzidine, tetrahydrochloride

CAS号：7411-49-6

商品信息

储存条件：0-5度保存，避光

运输条件：室温

分子式：

C₁₂H₁₈Cl₄N₄

分子量：

360.11

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选择规格：

期货

细胞染色

DAB试剂货号：D006 3,3′-Diaminobenzidine, tetrahydrochloride CAS号：7411-49-6

产品简介

染色溶液的制备

参考文献

操作和储存条件

产品简介

DAB试剂货号：D006 3,3′-Diaminobenzidine, tetrahydrochloride CAS号：7411-49-6

DAB是在免疫组化中最常用的氧化型过氧化物酶显色底物之一。在过氧化氢和过氧化酶存在时，DAB被氧化成棕色的显色底物。这种棕色的显色底物是苯胺黑类化合物，可以牢固的沉积在细胞膜或组织上的过氧化物酶的周围。市面上销售的DAB往往由于生产和保存期间的氧化问题呈褐色。而同仁化学研究所的提供的高纯度DAB的性状呈白色或略带红色的灰色粉末，可以得到灵敏度更高的染色效果。

染色溶液的制备

1. 用1 ml PBS溶解9 mg DAB制备成100 x DAB solution。

2. 用1 ml PBS混合5 μl 的30%过氧化氢酶溶液制备成200 x H₂O₂ solution。

3. 向1 ml PBS中加入10 μl 的100 x DAB solution和5 μl的 200 x 的H₂O₂ solution制成Staining soluiton¹⁾。

4. 将Staining solution加入到染色容器中并将样品在室温下培养1 h²⁾。

5. 用PBS清洗样品数次使染色反应停止。

1) Staining solution不稳定，请现配现用。

2) 为了获得更好的染色效果，可以在加入Staining solution之前预先用0.09 mg DAB/PBS溶液培养样品10 min。

参考文献

1) A. B. Novikoff, et al., Studies on Microperoxisomes V. Are Microperoxisomes Ubiquitous in Mammalian Cells. J Histochem Cytochem. 1973;21:737.

2) V. Herzog, et al., A New Sensitive Colorimetric Assay for Peroxidaase Using 3, 3 EDiaminobenzidine as Hydrogen Donor. Anal Biochem. 1973;55:554.

3) H. Yamada, et al., Improvement of Technique of Immunohistochemical Demonstraction of Bioactive Substances in the Central Nervous System. Acta Histochem Cytochem. 1987;20:629.

4) K. L. Cheng, Determination of Traces of Selenium 3,3 EDiaminobenzidine as Selenium(IV) Organic Reagent. Anal Chem. 1956;28:1738.

操作和储存条件

规格：

性状：红色或略带红色的灰色粉末

纯度(滴定法)：≥97.0%(干燥固态)

水中溶解度：通过检测

Tris缓冲液中溶解度：通过检测

吸光度(硒化合物)：≧ 0.500 (420 nm附近)

干燥失重：≤5.0%

硫酸盐灰分：≤0.05%

IR谱图：一致

操作和储存条件：

0-5℃，避光

危险/有害性标志

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日本同仁化学FSB solution试剂货号：F308- DOJINDO

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FSB solution试剂货号：F308

1-Fluoro-2,5-bis(3-carboxy-4-hydroxystyryl)benzene, 1% DMSO solution

FSB solution

商品信息

储存条件：0-5度保存，避光

运输条件：室温

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选择规格：

100μl

期货

细胞染色

概述

产品使用步骤

病理切片染色实例

参考文献

常见问题Q&A

概述

淀粉样变性病被卫生部门确定为一种特殊的疾病，是一种具有β折叠结构的称为淀粉样物质的不正常蛋白质，它聚集成纤维，并沉淀在内部器官和系统的外面，抑制这些器官和系统的功能。日本人中这样的疾病包括免疫细胞淀粉样变性病 (AL 淀粉样变性病)、敏感性AA淀粉样变性病、家族性淀粉样多发性神经病 (FAP) 和透析淀粉样变性病(DRA)，并且据估计在日本有几百个这样的患者。淀粉样变性病大致可分为两类：沉积在全身各器官内的淀粉样物质[系统性淀粉样变性病]，例如上文中提到的病症；以及淀粉样物质沉积于特定器官中的 [局部淀粉样变性病]，例如在阿尔茨海默病中淀粉样物质沉积于大脑中。

1-溴-2,5-双(3-羧基-4-羟基苯乙烯基)苯 (BSB)用于检测淀粉样变性病，因为它与β-淀粉样肽 (Aβ)—与阿尔茨海默病相关的淀粉样物质，具有高亲和力。Skovronsky 证实，在静脉注射 BSB 18 小时之后，该染料在转基因小鼠 Tg2576 脑组织的老年斑中积累，该种转基因小鼠表达Aβ的淀粉样前体蛋白 (APP)。1) 不仅限于Aβ，Ando 以及其他研究者已宣布各种系统性淀粉样变性病 (AA、AL、ATTR、Ascr 及 Aβ2M) 中沉积的淀粉样物质用BSB比用刚果红 (一种常用于β折叠染色的染料) 染色更敏感。BSB的荧光强度是刚果红的两倍。此外，BSB 不仅是染色的染料，还能够阻断FAP的淀粉样物质前体TTR形成淀粉样物质。

产品使用步骤

样品的固定法

乙醇固定或福尔马林固定

染色操作方法

＊本品是由 1 %w/vDMSO 溶液制成可配制 0.01%浓度溶液 10 ml,可配制 0.000 1%浓度溶液 1000 ml

1. FSB染色液配制

向产品中加入50 %的乙醇并稀释成浓度为0.01-0.0001 %的 FSB溶液

2. 染色

将切片在 FSB 中浸泡 30 min。再浸入饱和碳酸锂中然后用50%乙醇洗涤

3. 检测

紫外光(V 激发) 下检测染色区域

＊如果使用 MRI 法参考如下文献

M. Higuchi, N. Iwata, Y. Matsuba, K. Sato, K. Sasamoto, T. C.Saido, 19F and 1H MRI detection of amyloid β plaques in vivo, Nature Neuroscience, 2005, 8(4), 527-33

病理切片染色实例

1、一个患有阿尔茨海默病患者的前皮质截面染色图。该组织用乙醇固定。发光部分为淀粉样物质。

Sub-adjacent 切片图中的数字对应于每个老年斑。

FSB solution试剂货号：F308

(图片由日本理化学研究所脑科学综合研究中心 Higuchi博士和 Saido 博士慷慨提供)

2、患有AL淀粉样变性病患者的心脏组织切片(刚果红是赤褐色的，BSB和FSB的发光部分为淀粉样物质)。Sub-adjacent切片。可以用FSB检测良好的部分，并且这些部分与淀粉样沉淀部分的对比是清晰的。

FSB solution试剂货号：F308

(图像由Ando博士慷慨提供：熊本大学医学院，实验医学部)

3、FSB在静脉内注射，通过 in vivo MRI图像技术，检测患阿尔茨海默病小鼠脑部照片，可观察到淀粉样沉淀物 (老年斑)。

图像 A：19F-MRI图像、图像B:1H-MRI T2 放大图像、图像C：荧光显微镜下的荧光图像 (exvivo) 图像B中可观查到老人斑低信号 (黑) 部分。FSB的分布情况可在荧光显微镜下确认 (图像C)，但相同检测部位通过19F-MRI现象检测 (图像A)，可以更清晰的检测出 (图像B) 中检测不到或不清晰的部分。

FSB solution试剂货号：F308

注意事项：购买后根据自己的用量分装保存

参考文献

1. 19F and 1H MRI detection of amyloid β plaques in vivo, Nature Neuroscience, 2005, 8(4), 527-33

2. An aberrant sugar modification of BACE1 blocks its lysosomal targeting in Alzheimer’s disease,

EMBO Molecular Medicine, 2015, 7, 175-189

3. Imaging of Peripheral Benzodiazepine Receptor Expression as Biomarkers of Detrimental versus Beneficial Glial Responses in

Mouse Models of Alzheimer’s and Other CNS Pathologies, The Journal of Neuroscience, 2008, 28(47), 12255-12267

4. Longitudinal, quantitative assessment of amyloid, neuroinflammation, and anti-amyloid treatment in a living mouse model of

Alzheimer’s disease enabled by positron emission tomography, The Journal of Neuroscience, 2007, 27(41), 10957-10968

常见问题Q&A

Q1：FSB荧光观察时的激发波长和发射波长。

A1：激发波长：390 nm, 发射波长：511 nm

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日本同仁化学Cellstain- AO solution试剂货号：A430 3,6-Bis(dimethylamino)acridine, hydrochloride, solution CAS号：65-61-2(AO)- DOJINDO

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Cellstain- AO solution试剂货号：A430

3,6-Bis(dimethylamino)acridine, hydrochloride, solution

CAS号：65-61-2(AO)

商品信息

储存条件：-20度保存，避光

运输条件：室温

分子式：

C₁₇H₂₀ClN₃

分子量：

301.81

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1ml

期货

细胞染色检测方案

Cellstain- AO solution试剂货号：A430 3,6-Bis(dimethylamino)acridine, hydrochloride, solution CAS号：65-61-2(AO)

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日本同仁化学Cellstain- Hoechst 33258 solution细胞核染色试剂货号：H341- DOJINDO

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Cellstain- Hoechst 33258 solution细胞核染色试剂货号：H341

2′-(4-Hydroxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5′-bi-1H-benzimidazole, trihydrochloride

CAS号：23491-45-4

商品信息

储存条件：0-5度保存，避光

运输条件：室温

分子式：

C₂₅H₂₇Cl₃N₆O

分子量：

533.88

特点：

● 可用于活/死细胞DNA检测

● 蓝色荧光，毒性低

● 试剂盒稳定性高。

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现货

细胞染色

规格性状

产品概述

荧光特性

原理

操作说明

文献

常见问题Q&A

规格性状

规格

特性：该产品为黄色液体。

内容：试验成功

产品概述

荧光染料Hoechst 33258是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，也称bisBenzimide H 33258或HOE 33258,常用于细胞凋亡检测。

Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。

Hoechst染料可透过细胞膜并对DNA染色而发出强烈的蓝色荧光。它们在聚AT序列的富集区域的小沟处与DNA结合。Hoechst 33258和Hoechst 33342均可溶于水并在水溶液中保持稳定。Hoechst-DNA的激发和发射波长分别为350 nm和460 nm。

Cellstain- Hoechst 33258 solution细胞核染色试剂货号：H341

荧光特性

λex=350nm, λem=461nm

原理

Cellstain- Hoechst 33258 solution细胞核染色试剂货号：H341

操作说明

染色步骤

1.用PBS或适当的缓冲液制备10-50μMHoechst染料溶液。^a）

2.在细胞培养基中加入体积为细胞培养基1/10的Hoechst染料溶液。^b）

3.将细胞在37ºC下孵育10-20分钟。

4.用PBS或适当的缓冲液清洗细胞两次。

5.在带有350 nm激发和460 nm发射滤光片的荧光显微镜下观察细胞。

a）由于赫斯特染料可能具有致癌性，因此在处理过程中必须格外小心。

b）或者您可以用1/10浓度的Hoechst染料缓冲溶液代替培养基。

文献

1) M. J. Lydon, K. D. Keeler and D. B. Thomas, “Vital DNA Staining and Cell Sorting by Flow Microfluorometry”, J. Cell Physiol., 1980, 102(2), 175.

2) M. Sriram, van der G. A. Marel, H. L. Roelen, van J. H. Boo and A. H. Wang, “Structural Consequences of a Carcinogenic Alkylation Lesion on DNA: Effect of O6-ethylguanine on the Molecular Structure of the d(CGC[e6G]AATTCGCG)-netropsin Complex”, Biochemistry, 1992, 31(47), 11823.

3) T. Ohara and T. Tsuge, “FoSTUA, Encoding a Basic Helix-Loop-Helix Protein, Differentially Regulates Development of Three Kinds of Asexual Spores, Macroconidia, Microconidia, and Chlamydospores, in the Fungal Plant Pathogen Fusarium oxysporum”, Eukaryot. Cell, 2004, 3, 1412.

常见问题Q&A

Q1:如何使用Hoechst 33258。

A1：有多种使用方法，但以形态观察为例。

它用作观察凋亡细胞中核变化（染色质浓缩，断裂）的简便方法。

<试剂>

・细胞固定液：1％戊二醛/ PBS（-）

・荧光染色：1 mM Hoechst33258 / PBS（-）

•Dojindo的产物为[1 mg / mL]（约1.87 mmol / L）

<操作方法>

1. 将含有约1 x 106个细胞的细胞培养基以400 Xg离心5分钟，并弃去上清液。

2.加入100μL细胞固定溶液，并通过移液或类似方法混合。

3.在室温下静置30分钟。

4.离心400Xg，5分钟，弃去上清液。

加入1 mL PBS（-），用移液器等混合，以400Xg离心5分钟，弃去上清液。

（*此时，戊二醛经常被洗涤和去除。可能会导致变色）

5.添加20μLPBS（-）并混合，然后添加4μL荧光染料并混合。

6.将1滴（5）的细胞溶液滴在载玻片上，盖上玻璃盖，然后按边缘。

7.在荧光显微镜下观察。

*由田沼靖（Yasushi Tanuma）指导的细胞工程独立体积实验规程系列“细胞凋亡实验规程”

Q2：细胞染料的激发波长和发射波长是多少。

A2：

Cellstain- Hoechst 33258 solution细胞核染色试剂货号：H341

Q3：Hoechst 33258和Hoechst 33342解决方案的激发波长和发射波长及其区别。

A3:波长如下。
Hoechst33342 Ex：350 nm Em：461 nm
Hoechst33258 Ex：352 nm Em：461 nm

两者的基本用法是相同的。
我们的产品是水溶液，所以稀释至所需浓度并添加。

两者之间的区别在于，它基本上是一种特异性结合腺嘌呤-胸苷部分的药物。
它也穿过活细胞的膜并与活细胞的DNA结合。
Hoechst 33342的膜渗透性略高。
Hoechst 33258似乎是dsDNA的选择性抗体。

日本同仁化学Cellstain- Hoechst 33342 solution试剂货号：H342- DOJINDO

发表于2024年6月19日由whatman中国官网

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Cellstain- Hoechst 33342 solution试剂货号：H342

2′-(4-Ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5′-bi-1H-benzimidazole, trihydrochloride

CAS号：23491-52-3

商品信息

储存条件：0-5度保存，避光

运输条件：室温

分子式：

C₂₇H₃₁Cl₃N₆O

分子量：

561.93

特点：

● 结合活细胞DNA

● 试剂盒稳定性高。

● 激发和发射波长分别为350 nm和460 nm

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1 ml

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细胞染色

Cellstain- Hoechst 33342 solution试剂货号：H342

活动进行中

规格性状

产品概述

荧光特性

文献

常见问题Q&A

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NO.5. Caspase-3 Assay Kit-Colorimetric- 细胞凋亡检测

规格性状

规格

特性：该产品为黄色液体

含量：试验成功

产品概述

荧光染料Hoechst 33342是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，也称bisBenzimide H33342或HOE33342常用于细胞凋亡检测。

Hoechst 33342是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。

Cellstain- Hoechst 33342 solution试剂货号：H342

荧光特性

λex=352 nm, λem=461 nm

文献

1) M. J. Lydon, K. D. Keeler and D. B. Thomas, “Vital DNA Staining and Cell Sorting by Flow Microfluorometry”, J. Cell Physiol., 1980, 102(2), 175.

3) Y. Tadokoro, K. Yomogida, Y. Yagura, S. Yamada, M. Okabe and Y. Nishimune, “Characterization of Histone H2A.X Expression in Testis and Specific Labeling of Germ Cells at the Commitment Stage of Meiosis with Histone H2A.X Promoter-Enhanced Green Fluorescent Protein Transgene”, Biol. Reprod., 2003, 69, 1325.

4) F. Wada, A. Ogawa, Y. Hanai, A. Nakamura, M. Maki and K. Hitomi, “Analyses of Expression and Localization of Two Mammalian-Type Transglutaminases in Physarum polycephalum, an Acellular Slime Mold”, J. Biochem.(Tokyo), 2004, 136, 665.

5) M. Oka, N. Kobayashi, K. Matsumura, M. Nishio and K. Saeki, “Exogenous Cytokine-Free Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Classical Brown Adipocytes”, Cells., 2019, 8, (4), 373

6) T. Yamazaki, H. Suzuki, S. Yamada, K. Ohshio, M. Sugamata, T. Yamada and Y. Morita, “Lactobacillus paracasei KW3110 Suppresses Inflammatory Stress-Induced Premature Cellular Senescence of Human Retinal Pigment Epithelium Cells and Reduces Ocular Disorders in Healthy Humans”, Int J Mol Sci, 2020, 21(14), 5091

常见问题Q&A

Q1:如何使用Hoechst 33258。

A1：有多种使用方法，但以形态观察为例。

它用作观察凋亡细胞中核变化（染色质浓缩，断裂）的简便方法。

<试剂>

・细胞固定液：1％戊二醛/ PBS（-）

・荧光染色：1 mM Hoechst33258 / PBS（-）

•Dojindo的产物为[1 mg / mL]（约1.87 mmol / L）

<操作方法>

1. 将含有约1 x 106个细胞的细胞培养基以400 Xg离心5分钟，并弃去上清液。

2.加入100μL细胞固定溶液，并通过移液或类似方法混合。

3.在室温下静置30分钟。

4.离心400Xg，5分钟，弃去上清液。

加入1 mL PBS（-），用移液器等混合，以400Xg离心5分钟，弃去上清液。

（*此时，戊二醛经常被洗涤和去除。可能会导致变色）

5.添加20μLPBS（-）并混合，然后添加4μL荧光染料并混合。

6.将1滴（5）的细胞溶液滴在载玻片上，盖上玻璃盖，然后按边缘。

7.在荧光显微镜下观察。

*由田沼靖（Yasushi Tanuma）指导的细胞工程独立体积实验规程系列“细胞凋亡实验规程”

Q2：细胞染料的激发波长和发射波长是多少。

A2：

Cellstain- Hoechst 33342 solution试剂货号：H342

Q3：Hoechst 33258和Hoechst 33342解决方案的激发波长和发射波长及其区别。

A3:波长如下。
Hoechst33342 Ex：350 nm Em：461 nm
Hoechst33258 Ex：352 nm Em：461 nm

两者的基本用法是相同的。
我们的产品是水溶液，所以稀释至所需浓度并添加。

日本同仁化学Cellstain- DAPI试剂货号：D212 4’6-二脒-2-苯胺，二盐酸盐 Cellstain- DAPI- DOJINDO

发表于2024年6月19日由whatman中国官网

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Cellstain- DAPI试剂货号：D212

4’6-二脒-2-苯胺，二盐酸盐

Cellstain- DAPI

商品信息

储存条件：-20度保存，避光

运输条件：室温

分子式：

C₁₆H₁₇Cl₂N₅

分子量：

350.25

特点：

● 可用于流式细胞仪

● 活细胞核染色试剂

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选择规格：

1 mg

现货

细胞染色

Cellstain- DAPI试剂货号：D212 4’6-二脒-2-苯胺，二盐酸盐 Cellstain- DAPI

规格性状

产品概述

荧光特性

操作说明

文献

常见问题Q&A

规格性状

规格

特性：该产物为黄色至微黄色的绿棕色粉末或固体，可溶于水和稀盐酸。

水溶性：试验成功

NMR光谱：试验成功

产品概述

荧光染料DAPI是一种可对DNA 染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测。DAPI是含有特定AT序列DNA的一种嵌入剂，它能像Hoechst染料一样粘附在DNA双螺旋的小沟区。尽管DAPI不能通过活细胞膜，但却能穿透扰乱的细胞膜而对细胞核染色。DAPI具有很高的光漂白承受水平，能用来检测酵母线粒体DNA，叶绿体DNA，病毒DNA，microplasm DNA以及染色体DNA。DAPI-DNA复合物的激发和发射波长分别为360 nm和460 nm。

Cellstain- DAPI试剂货号：D212 4’6-二脒-2-苯胺，二盐酸盐 Cellstain- DAPI

荧光特性

λex=360 nm, λem=460 nm

操作说明

产品使用步骤

1.用PBS或适当的缓冲液制备10-50μMDAPI溶液。^a）

2.在细胞培养基中加入体积为细胞培养基1/10的DAPI溶液。^b）

3.将细胞在37℃下孵育10-20分钟。

4.用PBS或适当的缓冲液清洗细胞两次。

5.使用带有360 nm激发光和460 nm发射滤光片的荧光显微镜观察细胞。

a）由于DAPI可能致癌，因此在处理过程中必须格外小心。

b）或者您可以用1/10浓度的DAPI缓冲溶液代替培养基。

注意事项

制备DAPI储备溶液时要用水（难溶于PBS）。

但是，那些溶解在水中的物质不适合长期储存。

考虑长期存储时，请使用解决方案类型产品-Cellstain®-DAPI解决方案（代码：D523），以提高解决方案的稳定性。

文献

1) W.Schnedl,A.V.Mikelsaar,M.Breitenbach and O.Dann,”DIPI and DAPI: Fluorescence Banding with Only Negligible Fading”,Hum. Genet.,1977,36,167.

2) I.W.Taylor and B.K.Milthorpe,”An Evaluation of DNA Fluochromes, Staining Techniques, and Analysis for Flow Cytometry. I. Unperturebed Cellpopulations”,J.Histochem. Cytochem., 1980, 28(11), 1224.

3) F.Otto and K.G.Tsou,”A Comparative Study of DAPI,DIPI,and Hoechst 33258 and 33342 as Chromosomal DNA Stains”, Stain Technol.,1985, 60, 7.

4) N.Poulin, A.Harrison and B.Palcic,”Quantitative Precision of an Automated Image Cytometric System for the Measurement of DNA Content and Distribution in Cells Labeled with Fluorescent Nucleic Acid Stains”, Cytometry, 1994,16,227.

5)M.Kawai,N.Yamaguchi and M.Nasu,”Rapid Enumeration of Physiologically Active Bacteria in Purified Water Used in the Pharmaceutical Manufacturing Process”, J.Appl. Microbiol.,1999, 86 (3),496.

常见问题Q&A

Q1 核染色中所用染料的特征和区别是什么？

A1:这里引入的染料具有通过与核酸相互作用而发出荧光或增加荧光强度的特性。

除荧光波长以外的差异如下。

[EB]

它没有碱基特异性，可与所有DNA和RNA结合。

它没有活细胞的膜通透性，并且可以染色死细胞。

[PI]

像EB一样，它没有基础特异性。它是一种更广泛使用的染料，因为插入时它的荧光强度比EB高。

它没有活细胞的膜通透性，并且可以染色死细胞。

[DAPI]

与双链小槽结合。它与腺嘌呤-胸苷簇具有高度结合。

它没有活细胞的膜通透性，并且可以染色死细胞。

[AO]

通过利用插入双链时和与单链磷酸结合时荧光波长不同的事实，可以在双链和单链之间进行区分。

它渗透到活细胞的细胞膜上。

[Hoechst33342，33258]

它与DNA的腺嘌呤胸苷部分特异性结合。

它是一种颜料，可以渗透到活细胞的细胞膜上并染色活细胞的DNA。

Q2：细胞染料的激发波长和发射波长是多少。

A2：

Cellstain- DAPI试剂货号：D212 4’6-二脒-2-苯胺，二盐酸盐 Cellstain- DAPI

Q3 如何使用DAPI进行核染色？

A3:有以下使用情况报告示例。制备DAPI储备溶液时要用水（难溶于PBS）。

但是，那些溶解在水中的物质不适合长期储存。

对于长期存储，请使用解决方案类型产品-Cellstain®-DAPI解决方案（货号：D523），具有更高的解决方案稳定性。使用时，用缓冲液或有机溶剂将储备溶液稀释至所需浓度。

[使用DAPI进行细胞染色的示例]

包含实体瘤或簇的样品的DAPI染色示例（参考文献3）

1）用0.02％胰蛋白酶-EDTA处理，在37°C下孵育30分钟，以1,500 rpm离心5分钟，然后冲洗上清液。

2）在-20°C下用50％甲醇（也可以使用乙醇）固定后，以1,500 rpm离心5分钟以除去上清液。

3）在-20℃下用30％甲醇洗涤后，以1,500rpm离心5分钟以除去上清液。

4）用0.2 M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）洗涤后，以1,500 rpm离心5分钟以除去上清液。

5）每106个细胞添加0.2 mL的RNase的0.2 M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）（pH 7.2）（1 mg / mL），并在37°C下孵育30分钟。

6）用0.2 M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）洗涤后，以1,500 rpm离心5分钟以除去上清液。

7）加入10 mL 1μg/ mL DAPI溶液，并在黑暗中于4°C染色2小时。

[使用DAPI进行细胞染色的例子] Vollenweider等人在磷酸化因子激活的杀伤（LAK）细胞的细胞增殖试验中。

使用荧光打印机执行DAPI染色并进行测量（参考2）。

那时，请使用0.1 mg / mL的水溶液和1μg/ mL的甲醇溶液。

使用每孔100μL进行荧光染色。

日本同仁化学Cellstain- PI solution试剂货号：P378 CAS号：25535-16-4- DOJINDO

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3,8-二氨基-5-[3-(二乙基家氨基)丙基]-6-苯基啡啶二碘，水溶液（3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide,aqueous solution）

CAS号：25535-16-4

商品信息

储存条件：-20度保存，避光

运输条件：室温

分子式：

C₂₇H₃₄I₂N₄

分子量：

668.39

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1 ml

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细胞染色

Cellstain- PI solution试剂货号：P378 CAS号：25535-16-4

关联产品

Calcein-AM/PI细胞双染试剂盒

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3′,6′-Di(O-acetyl)-4′,5′-bis[N,N-bis(carboxymethyl)aminomethyl]fluorescein, tetraacetoxymethyl ester

Cellstain- Hoechst 33342 solution试剂

2′-(4-Ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5′-bi-1H-benzimidazole, trihydrochloride

PlasMem Bright Green细胞膜染色试剂

细胞膜染色试剂—绿色

Cellstain- CFSE试剂

5- or 6-(N-Succinimidyloxycarbonyl)fluorescein 3′,6′-diacetate

在线小工具

实验工具|稀释计算器|摩尔浓度计算器

日本同仁化学Cellstain- PI试剂货号：P346 CAS号：25535-16-4- DOJINDO

发表于2024年6月19日由whatman中国官网

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Cellstain- PI试剂货号：P346

3,8-二氨基-5-[3-(二乙基家氨基)丙基]-6-苯基啡啶二碘（3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide）

CAS号：25535-16-4

商品信息

储存条件：0-5度保存，避光

运输条件：室温

分子式：

C₂₇H₃₄I₂N₄

分子量：

668.39

特点：

● 与死细胞DNA结合

● 常用于细胞凋亡检测

● 可与Calcein-AM或者FDA等荧光探针一起使用

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选择规格：

1 mg

现货

细胞染色

活动进行中

规格性状

产品概述

荧光特性

操作说明

文献

常见问题Q&A

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凑单关联产品TOP5

NO.1. Calcein-AM 细胞质染色

NO.2. GSSG/GSH Quantification Kit II 氧化型/还原型谷胱甘肽

NO.3. Amine Coupling Kit 自组装单分子膜SAM

NO.4. Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit 细胞凋亡检测

NO.5. Annexin V, 633 Apoptosis Detection Kit 细胞凋亡检测

规格性状

规格

特性：该产品为红棕色粉末或固体，易溶于水和稀盐酸。

水溶性：试验成功

NMR光谱：试验成功

产品概述

荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是Propidium Iodide。它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。PI经常被用来与Calcein-AM或者FDA等荧光探针一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm和615nm。

Cellstain- PI试剂货号：P346 CAS号：25535-16-4

荧光特性

λex=530 nm, λem=620 nm

操作说明

1.用PBS或适当的缓冲液制备10-50μMPI溶液。^a）

2.在细胞培养基中加入体积为细胞培养基1/10的PI溶液。^b）

3.将细胞在37^oC下孵育10-20分钟。

4.用PBS或适当的缓冲液清洗细胞两次。

5.在带有535 nm激发光和615 nm发射滤光片的荧光显微镜下观察细胞。

a）由于PI可能致癌，因此在处理过程中必须格外小心。

b）或者您可以用1/10浓度的PI缓冲溶液代替培养基。

文献

1) I. W. Taylor and B. K. Milthorpe, “An Evaluation of DNA Fluochromes, Staining Techniques, and Analysis for Flow Cytometry. I. Unperturebed Cellpopulations”, J. Histochem. Cytochem., 1980, 28(11), 1224.

2) W. M. J. Vuist, F. V. Buitenen, M. A. De Rie, A. Hekman, P. Ruemke and C. J. M. Melief, “Potentiation by Interleukin 2 of Burkitt’s Lymphoma Therapy with Anti-Pan B (Anti-CD19) Monoclonal Antibodies in a Mouse Xenotransplantation Model”, Cancer Res., 1989, 49, 3783.

3) A. K. El-Naggar, J. G. Batsakis, K. Teague, L. Garnsey and B. Barlogie, “Single- and Double-stranded RNA Measurements by Flow Cytometry in Solid Neoplasms”, Cytometry, 1991, 12, 330.

4) C. Souchier, M. Ffrench, M. Benchaib, R. Catallo and P. A. Bryon, “Methods for Cell Proloferation Analysis by Fluorescent Image Cytometry”, Cytometry, 1995, 20, 203.

5) T. Irino, T. Kitoh, K. Koami, T. Kashima, K. Mukai, E. Takeuchi, T. Hongo, T. Nakahata, S. M. Schuster and M. Osaka, “Establishment of Real-Time Polymerase Chain Reaction Method for Quantitative Analysis of Asparagine Synthetase Expression”, Mol. Diagn., 2004, 6, 217.

常见问题Q&A

Q1:核染色中所用染料的特征和区别是什么？

A1：

这里引入的染料具有通过与核酸相互作用而发出荧光或增加荧光强度的特性。

除荧光波长以外的差异如下。

[EB]

它没有碱基特异性，可与所有DNA和RNA结合。

它没有活细胞的膜通透性，并且可以染色死细胞。

[PI]

像EB一样，它没有基础特异性。它是一种更广泛使用的染料，因为插入时它的荧光强度比EB高。

它没有活细胞的膜通透性，并且可以染色死细胞。

[DAPI]

与双链小槽结合。它与腺嘌呤-胸苷簇具有高度结合。

它没有活细胞的膜通透性，并且可以染色死细胞。

[AO]

通过利用插入双链时和与单链磷酸结合时荧光波长不同的事实，可以在双链和单链之间进行区分。

它渗透到活细胞的细胞膜上。

[Hoechst33342，33258]

它与DNA的腺嘌呤胸苷部分特异性结合。

它是一种颜料，可以渗透到活细胞的细胞膜上并染色活细胞的DNA。

Q2：细胞染料的激发波长和发射波长是多少。

A2：

Cellstain- PI试剂货号：P346 CAS号：25535-16-4

Q3:如何使用PI进行核染色？

A3:一个例子如下所示。根据细胞类型和观察条件，考虑细胞固定和试剂浓度。

[使用示例①]

Vollenweider等人进行了PI染色，并在荧光素激活的杀伤（LAK）细胞增殖试验中使用了荧光板读数器进行了测量。

此时的浓度为0.5 mg / mL PBS（-）。所用浓度为5μg/ mL柠檬酸钠溶液，每孔100μL用于荧光染色。

·I.Vollenweider，P.Groscurth，J.Immunol.Methods，149，133（1992）。

[用法示例（2）]

（1）对于包含实体瘤或团块的样品，请用0.02％tripsin EDTA处理。

在37°C下孵育30分钟后，以1500 rpm进行5分钟，然后弃去上清液。

（2）在-20℃用50％甲醇固定后，以1500rpm进行5分钟，并弃去上清液。

（3）在-20℃下用30％甲醇洗涤后，以1500rpm进行5分钟，弃去上清液。

（4）用0.2 mol / L磷酸盐缓冲液（pH 7.2）洗涤后，以1500 rpm进行5分钟，并弃去上清液。

（5）每106个细胞RNase 0.2 mol / L磷酸盐缓冲液（pH 7.2）溶液（1 mg / mL）

加入0.2 mL，并在37°C下孵育30分钟。

（6）用0.2 mol / L磷酸盐洗涤后，以1500 rpm进行5分钟，并弃去上清液。

（7）加入10 mL PI溶液（50μg/ mL），在黑暗中于4°C染色2小时。

・医学院出版《流式细胞仪入门》

日本同仁化学Nucleolus Bright Red试剂货号：N512 核仁荧光染色试剂-红色- DOJINDO

发表于2024年6月19日由whatman中国官网

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Nucleolus Bright Red试剂货号：N512

核仁荧光染色试剂-红色

Nucleolus Bright Red

商品信息

储存条件：冷暗处保存

运输条件：室温

特点：

● 高特异性核仁定位

● 可通过共聚焦定量细胞成像仪进行定量分析

● 两种颜色可供选择

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选择规格：

60 nmol

现货

衰老检测方案

Nucleolus Bright Red试剂货号：N512 核仁荧光染色试剂-红色

活动进行中

荧光特性

产品概述

原理

核仁染色试剂的比较

产品特点

衰老细胞的评价例

产品实验例

核仁数分析

常见问题Q&A

产品文献

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指标	关联指标干货参考（点击查看）	检测指标（点击查看）
DNA损伤检测	γ-H2AX	DNA损伤检测试剂盒- γH2AX（绿、红、深红）
	AP位点	DNA损伤检测试剂盒（AP位点法）
	核小体	Nucleolus Bright (绿、红）
	细胞周期	Cell Cycle Assay Kit – PI/RNase Staining
DNA损伤关联指标	氧化损伤	DMPO
		BMPO
		TEMP
		SOD Assay Kit
		DPPH Antioxidant Assay Kit
	凋亡	Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit/PI
		Annexin V, 633 Apoptosis Detection Kit/PI
		Cell Cycle Assay Solution Deep Red/Blue
		JC-1 MitoMP Detection Kit
		Caspase-3 Assay Kit
	铁死亡	Lipid Peroxidation Probe -BDP 581/591 C11
		Liperfluo
		GSSG/GSH Quantification Kit II
		Iron Assay Kit
		Mito-FerroGreen
	衰老	Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal
		Cellular Senescence Plate Assay Kit – SPiDER-βGal
		SPiDER-βGal
	自噬	Mitophagy Detection Kit
		DALGreen – Autophagy Detection
		DAPGreen – Autophagy Detection
		DAPRed – Autophagy Detection

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荧光特性

Nucleolus Bright Red试剂货号：N512 核仁荧光染色试剂-红色

产品概述

Nucleolus Bright是一种选择性与RNA结合并产生荧光的小分子荧光染料，只需在固定细胞中加入试剂即可成像。虽然Nucleolus Bright也会和在核仁以外存在的RNA反应，不过核仁作为细胞内RNA最多存在rRNA的产生场所，荧光尤为强烈。

成像时，通过与核染色试剂DAPI[产品货号：D523]共染色，可以更清楚地确认核仁。有关详细信息，请参阅使用说明书中的实验例。

原理

核仁是不带膜的核内结构体，也是核糖体生物合成的起点。核仁中存在许多核糖体RNA(rRNA)，并且是 rRNA基因转录以及合成加工的场所。由于蛋白质合成的早期阶段在核仁中进行，因此核仁的变化被认为与多种细胞活动有关。核仁的形态变化已被公认为判断癌症的指标之一，近年来也有一系列的报道论述了核仁应激与DNA损伤、自噬、病毒感染和细胞衰老的关系，因此核仁在这些方面的研究也受到越来越多的关注。

Nucleolus Bright Red试剂货号：N512 核仁荧光染色试剂-红色

核仁染色试剂的比较

最大激发波长

最大发射波长

MeOH固定后染色

PFA固定后染色

活细胞染色

Nucleolus Bright Green

513 nm

538 nm

〇

△※

Nucleolus Bright Red

537 nm

605 nm

〇

△※

※希望通过活细胞进行评价时，请咨询公司技术支持。

产品特点

特点1：清晰地观察核仁

用4％ PFA或MeOH固定HeLa细胞后，用PBS洗净后用1％ Triton X-100进行破膜处理，加入Nucleolus Bright Green或Red和核染色

试剂 (DAPI) 并培养，然后用共聚焦荧光显微镜观察。

结果证实DAPI染色的细胞核内 (蓝色)有数个核仁存在。

Nucleolus Bright Red试剂货号：N512 核仁荧光染色试剂-红色

<染色条件>

・PFA 固定

细胞在4％PFA室温下浸泡5 min，再用Triton X-100在室温下浸泡20 min，加入各种荧光探针后培养5 min。

・MeOH 固定

细胞在冷的MeOH中浸泡1 min，再用Triton X-100在室温下浸泡20 min，加入各种荧光探针后培养5 min。

<检测条件>

Nucleolus Bright Green Ex: 488 nm / Em: 500-600 nm

Nucleolus Bright Red Ex: 561 nm / Em: 565-650 nm

DAPI Ex: 405 nm / Em: 450-495 nm

特点2：核仁定位

用4％PFA固定WI-38细胞后，用抗Fibrillarin一抗和荧光标记的二抗免疫染色，并加入Nucleolus Bright Green或Red和核染色试剂

(DAPI) ，培养后，用落射式荧光显微镜 (Keyence，BZ-X710) 观察。

结果证实Nucleolus Bright Green和Nucleolus Bright Red与核仁标记物(Dense Fibrillar Component)的染色部位一致。

＜检测条件＞

Nucleolus Bright Green：Ex: 450-490 nm / Em: 500-550 nm

Nucleolus Bright Red：Ex: 533-548 nm / Em: 570-640 nm

DAPI：Ex: 340-380 nm / Em: 435-485 nm

Anti-Fibrillarin 抗体：Ex: 590-650 nm / Em: 668-733 nm

特点:3：与核仁相关的领域的报告示例

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Nucleolus Bright Green试剂货号：N511

核仁荧光染色试剂-绿色

Nucleolus Bright Green

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衰老

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原理

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	AP位点	DNA损伤检测试剂盒（AP位点法）
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		BMPO
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	凋亡	Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit/PI
		Annexin V, 633 Apoptosis Detection Kit/PI
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		SPiDER-βGal
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产品概述

成像时，通过与核染色试剂DAPI[产品货号：D523]共染色，可以更清楚地确认核仁。有关详细信息，请参阅使用说明书中的实验例。

原理

Nucleolus Bright Green试剂货号：N511 核仁荧光染色试剂-绿色

核仁染色试剂的比较

最大激发波长

最大发射波长

MeOH固定后染色

PFA固定后染色

活细胞染色

Nucleolus Bright Green

513 nm

538 nm

〇

△※

Nucleolus Bright Red

537 nm

605 nm

〇

△※

※希望通过活细胞进行评价时，请咨询公司技术支持。

产品特点

特点1：清晰地观察核仁

用4％ PFA或MeOH固定HeLa细胞后，用PBS洗净后用1％ Triton X-100进行破膜处理，加入Nucleolus Bright Green或Red和核染色

试剂 (DAPI) 并培养，然后用共聚焦荧光显微镜观察。

结果证实DAPI染色的细胞核内 (蓝色)有数个核仁存在。

Nucleolus Bright Green试剂货号：N511 核仁荧光染色试剂-绿色

<染色条件>

・PFA 固定

细胞在4％PFA室温下浸泡5 min，再用Triton X-100在室温下浸泡20 min，加入各种荧光探针后培养5 min。

・MeOH 固定

细胞在冷的MeOH中浸泡1 min，再用Triton X-100在室温下浸泡20 min，加入各种荧光探针后培养5 min。

<检测条件>

Nucleolus Bright Green Ex: 488 nm / Em: 500-600 nm

Nucleolus Bright Red Ex: 561 nm / Em: 565-650 nm

DAPI Ex: 405 nm / Em: 450-495 nm

特点2：核仁定位

用4％PFA固定WI-38细胞后，用抗Fibrillarin一抗和荧光标记的二抗免疫染色，并加入Nucleolus Bright Green或Red和核染色试剂

(DAPI) ，培养后，用落射式荧光显微镜 (Keyence，BZ-X710) 观察。

结果证实Nucleolus Bright Green和Nucleolus Bright Red与核仁标记物(Dense Fibrillar Component)的染色部位一致。

＜检测条件＞

Nucleolus Bright Green：Ex: 450-490 nm / Em: 500-550 nm

Nucleolus Bright Red：Ex: 533-548 nm / Em: 570-640 nm

DAPI：Ex: 340-380 nm / Em: 435-485 nm

Anti-Fibrillarin 抗体：Ex: 590-650 nm / Em: 668-733 nm

特点:3：与核仁相关的领域的报告示例

日本同仁化学BCECF-AM试剂货号：B262 3′-O-Acetyl-2′,7′-bis(carboxyethyl)-4 or 5-carboxyfluorescein, diacetoxymethyl ester CAS号：117464-70-7- DOJINDO

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BCECF-AM试剂货号：B262

3′-O-Acetyl-2′,7′-bis(carboxyethyl)-4 or 5-carboxyfluorescein, diacetoxymethyl ester

CAS号：117464-70-7

商品信息

储存条件：-20度保存，避光

运输条件：室温

分子式：

C₃₅H₂₈O₁₅

分子量：

688.59

特点：

● 水溶性好，可进入细胞膜

● 荧光强度高

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选择规格：

1mg

现货

荧光探针检测方案

BCECF-AM试剂货号：B262 3′-O-Acetyl-2′,7′-bis(carboxyethyl)-4 or 5-carboxyfluorescein, diacetoxymethyl ester CAS号：117464-70-7

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规格性状

产品概述

产品特性

操作说明

文献

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凑单关联产品TOP5

NO.1. Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit 细胞凋亡检测

NO.2. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测

NO.3. Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST 乳酸脱氢酶(LDH)检测

NO.4. Cell Viability Assay Kit 细胞增殖/毒性检测

NO.5. Fluo 4-AM special packaging 细胞内钙离子检测

规格性状

规格

特性：该产物为浅橙色至浅橙色棕色粉末或固体，可溶于DMSO和乙腈。

纯度(HPLC)：90%以上

荧光光谱：试验成功

NMR光谱：试验成功

产品概述

BCECF被广泛地用于细胞内pH的测定。Tsien博士和其他人通过加入2个额外的羧化物基团改进了这种羧基荧光素。加入的两个羧基使得它能更好地被固定在细胞内。BCECF具有很好的水溶性，是因为它在中性pH时带有4-5个负电荷。但是BCECF却很难穿过细胞膜进入到细胞内。它的pKa值为6.97，高于其它的羧基荧光素。BCECF在激发光谱439nm处有等吸收点，因此它能和Fura 2一样可用比率法测定。505nm和439nm通常是非常有用的用于比率测量的波长，一般会将490nm和450nm的滤光片加在激发光源的前面。而530nm的滤光片则是用来查看它的荧光信号的。这里要注意的是激发光谱与吸收光谱有一些细微的区别。BCECF-AM是乙酰甲酯化的BCECF。它能够轻易地进入到细胞内。就和其他的乙酰甲酯类一样，BCECF-AM只需要通过孵育就能进入细胞。BCECF-AM对潮湿非常敏感，所以要小心保存。如果DMSO储存液的颜色从浅黄色变为深橙色就代表了AM的分解。所以通过对颜色变化的观测，能判断AM酯的水解情况。

BCECF-AM试剂货号：B262 3′-O-Acetyl-2′,7′-bis(carboxyethyl)-4 or 5-carboxyfluorescein, diacetoxymethyl ester CAS号：117464-70-7

产品特性

BCECF-AM是一种对细胞内pH敏感的新型荧光探针，分别用490nm和440nm波长激发BCECF所得到的发射荧光之比与pH有很好的线性关系。BCECF-AM是乙酰甲酯化的BCECF，BCECF-AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，BCECF-AM没有荧光，进入细胞后被细胞内的酯酶水解成BCECF，从而被留在细胞内。BCECF在适当的pH值情况下可以被激发形成绿色荧光。BCECF-AM不仅被广泛用于哺乳动物细胞的研究，也有报道用于动物组织、植物细胞、细菌和酵母等的细胞内pH水平检测。在有细胞内pH变化的细胞毒性、细胞凋亡、细胞粘附、药物抵抗、细胞趋化等过程中BCECF AM被广泛应用。BCECF-AM(pH荧光探针)需用无水DMSO(anhydrous DMSO)配制。

BCECF-AM试剂货号：B262 3′-O-Acetyl-2′,7′-bis(carboxyethyl)-4 or 5-carboxyfluorescein, diacetoxymethyl ester CAS号：117464-70-7

操作说明

试剂 (溶解方法):

1.45 mM的BCECF-AM/DMSO溶液(将1 mg 的BCECF-AM溶于1mlDMSO)HEPES缓冲液(20mM HEPES，153mM NaCl，5mM KCl，5mM glucose，pH7.4)

操作：

1.用HEPES制备细胞悬液，细胞浓度为4×10⁷个/ml。

2.将1.45 mM的BCECF-AM/DMSO溶液加入细胞悬液中 (细胞悬液的1/300体积)，BCECF-AM终浓度为3mM。

3.37℃培养30min。

4.用HEPES缓冲液清洗细胞3次，制成3×10⁶个/ml的细胞悬液。

5.使用荧光显微镜或带有图像分析系统的激光共聚焦显微镜检测细胞的荧光强度。

*标记的条件因细胞种类而异，在每次实验前，请先确定最佳条件。以上方法仅供参考。

BCECF-AM试剂货号：B262 3′-O-Acetyl-2′,7′-bis(carboxyethyl)-4 or 5-carboxyfluorescein, diacetoxymethyl ester CAS号：117464-70-7

文献

1.R.A.Steinhardt, et al.,Development of K+-conductance and Membrane Potentials in Unfertilized Sea Urchin Eggs After Exposure to NH4OH. Nature.1973;241:400-401.

2.T.J.Rink, et al.,Cytoplasmic pH and Free Mg2+ in Lymphocytes.J Cell Biol.1982;95:189-196.

3.A.M.Paradiso,et al.,Na+ -H+ Exchange in Gastric Glands as Measured with a Cytoplasmic-trapped, Fluorescent pH Indicator. PNAS.1984;81:7436-7440.

4.S.Grinstein,et al.,Phorbol Ester-induces Changes of Cytoplasmic pH in Neutrophils:Role of Exocytosis in Na+ – H+ Exchange.Am J Physiol.1985;248:C379-C386.

5.G.B.Zavoico, et al.,Regulation of intracellular pH in human platelets.Effects of thrombin,A23187,and ionomycin and evidence for activation of Na+/H+ exchange and its inhibition by amiloride analogs.J Biol Chem.1986;261:13160-13167.

6.G.R.Bright,et al.,Fluorescence Ratio Imaging Microscopy: Temporal and Spatial Measurements of Cytoplasmic pH.J Cell Biol.1987;104:1019-1033.

7.C.Aalkjaer,et al.,Intracellular pH Regulation in Resting and Contracting Segments of Rat Mesenteric Resistance Vessels. J Physiol.1988;402:391-410.

8.K.Tsujimoto,et al.,Intracellular pH of Halobacteria Can Be Determined by the Fluorescent Dye 2 E 7 Ebis(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein.Biochem Biophys Res Commun.1988;155:123-129.

9.M.A.Kolber,et al.,Measurament of Cytotoxicity by Target Cell Release and Retention of the Fluorescent Dye Bis-carboxyethylcarboxyfluorescein(BCECF).J Immunol Methods.1988;108:255-264.

10.H.Harada,et al.,cAMP Activates Cl-/HCO3 – Exchange for Regulation of Intracellular pH in Renal Epithelial Cells. Biochim Biophys Acta. 1991;1092:404-407.11.C.C. Freudenrich, et al.,Intracellular pH Modulates Cytosolic Free Magnesium in Cultured Chicken Heart Cells.Am J Physiol.1992;262:C1024-C1030.

12.K.Khodakhah,et al.,Functional Heterogeneity of Calcium Release by Inositol Triphosphate in Single Purkinje Neurones, Cultured Cerebellar Astorocytes, and Peripheral Tissues. PNAS. 1993;90:4976-4980.

13.G.Boyarsky,et al.,Superiority of in vitro Over in vivo Calibrations of BCECF in Vascular Smooth Muscle Cells. FASEB J.1996;10:1205-1212.

14.S.A. Weston,et al., New Fluorescent Dyes for Lymphocyte Migration Studies Analysis by Flow Cytometry and Fluorescent Microscopy.J Immunol Methods.1990;133:87-97.

15.L.S.De Clerck,et al.,Use of Fluorescent Dyes in the Determination of Adherence of Human Leucocytes to Endothelial Cells and the Effects of Fluorochromes on Cellular Function.J Immunol Methods.1994;172:115-124.

日本同仁化学CFSE试剂货号：C309 5- or 6-(N-Succinimidyloxycarbonyl)fluorescein 3′,6′-diacetate CFSE- DOJINDO

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CFSE试剂货号：C309

5- or 6-(N-Succinimidyloxycarbonyl)fluorescein 3′,6′-diacetate

CFSE

商品信息

储存条件：-20度保存

运输条件：室温

分子式：

C₂₉H₁₉NO₁₁

分子量：

557.46

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选择规格：

10mg

期货

细胞染色检测方案

关联产品

CFSE试剂货号：C309 5- or 6-(N-Succinimidyloxycarbonyl)fluorescein 3′,6′-diacetate CFSE

Calcein-AM/PI细胞双染试剂盒

活死细胞双染试剂盒

活细胞质染色-绿色——Calcein-AM

3′,6′-Di(O-acetyl)-4′,5′-bis[N,N-bis(carboxymethyl)aminomethyl]fluorescein, tetraacetoxymethyl ester

Cellstain- Hoechst 33342 solution试剂

2′-(4-Ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5′-bi-1H-benzimidazole, trihydrochloride

PlasMem Bright Green细胞膜染色试剂

细胞膜染色试剂—绿色

Cellstain- CFSE试剂

5- or 6-(N-Succinimidyloxycarbonyl)fluorescein 3′,6′-d

日本同仁化学Cellstain- CFSE试剂货号：C375- DOJINDO

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Cellstain- CFSE试剂货号：C375

5- or 6-(N-Succinimidyloxycarbonyl)fluorescein 3′,6′-diacetate

CAS号：150347-59-4

商品信息

储存条件：-20度保存

运输条件：室温

分子式：

C₂₉H₁₉NO₁₁

分子量：

557.46

特点：

● 可用于细胞增殖检测

● 长效荧光染色，最长三周可见

● 可用于流式细胞仪检测

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选择规格：

1mg

现货

细胞染色检测方案

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原理

荧光特性

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常见问题Q&A

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规格性状

规格

特性：该产物为无色至微黄色固体，可溶于二甲基亚砜和乙腈。

可溶于二甲基亚砜：试验成功

NMR光谱：试验成功

产品概述

荧光染料 CFSE(CFDA-SE)，是一种可对活细胞进行荧光标记的新型染料，可以标记活体细胞。其基本原理如下：CFSE 是一种带有琥珀酰亚胺(NHS)的荧光染料，可以结合细胞内的蛋白质。CFSE 在结构上将酚羟基部位改造成 AM 体，所以自身不发荧光，荧光背景低，脂溶性高，能够轻易穿透细胞膜，在活细胞内与胞内蛋白共价结合，进入细胞内的 CFSE 的 AM 部位能被细胞内酯酶水解发出绿色荧光。CFSE 的琥珀酰亚胺(NHS)和细胞内蛋白质的氨基部位结合，固定在细胞内，不会漏出细胞外。CFSE 进入细胞后定位于细胞膜、细胞质和细胞核，在细胞核的荧光最强。

在细胞分裂增殖过程中，CFSE 的荧光强度会随着细胞的分裂而逐级递减，标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半，根据这一特性，它可被用于检测细胞增殖，细胞周期的估算及细胞分裂等方面。另外，CFSE 标记的细胞用于体内观察可以长达数周之久，它常被用来做活体细胞检测实验和用荧光电镜观察细胞长期活动的实验。有报道证实 CFSE 毒性小，不影响细胞的增殖能力。此方法操作简单，且不用放射性同位素，不存在安全隐患。可以更快速，更准确和更安全地得到想要的实验数据。

Cellstain- CFSE试剂货号：C375

原理

Cellstain- CFSE试剂货号：C375

荧光特性

荧光波长：λex=496 nm, λem=516 nm

操作说明

＊建议您在正式实验前先摸索一下细胞量、CFSE的终浓度、培养时间等，找到最佳实验条件。

配制试剂：

1、从冰箱中取出CFSE试剂，放至室温后再打开。盛放CFSE的管子开盖前请轻弹管壁几次，让粉末充分落入管底，必要时可采用离心的方法。

2、取0.9 ml DMSO^a)加到CFSE管中溶解，配制成2 mM的CFSE母液^b)（加入DMSO后请先盖上盖子，反复颠倒把盖子和管壁上的试剂洗到底部，并用移液器反复吹打使溶解完全）。

3、用PBS(-)或适当的缓冲液将其稀释成100 μM或其它浓度（如果采用载玻片观察法，建议浓度为20 μM的工作液^c))。

a) DMSO需要保证新鲜无水，否则将会导致AM体水解，使荧光染料无法进入细胞，影响实验效果。

b) 由于CFSE母液遇水极易分解，所以建议分装保存，例如分装成5 μl/管。

方法：分装后用封口膜密封管口，再用锡箔纸包裹，最后和干燥剂一起用塑料袋密封，≦-20℃冷冻保存。

c) CFSE工作液应现配现用，因为CFSE吸水会分解，影响染色效果。

* PBS(-)：不含钙和镁离子的PBS。

细胞染色(仅供参考)：

例1 培养板观察法

1、准备细胞悬液，用PBS(-)等合适的培养基^a)调整细胞浓度至约10⁷个／ml。

2、取1ml细胞悬液至试管中，加入适量CFSE工作液，轻轻搅拌混匀（建议CFSE的终浓度参考相关论文或做个预实验：分别设定终浓度为0.5,1,2,5,10,20 μM…,以确定最佳染色浓度^b)）。

3、在37℃培养箱中培养15-30分钟。

4、离心后去上清，加入2 ml PBS溶液，再离心后去上清，重复此操作一次。

5、加入合适的培养基制成细胞悬液。

6、取500 μl的细胞悬液加在培养孔中，用荧光显微镜观察，看到荧光后，根据自己实验的要求调整细胞数量^c)进行实验。

例2 载玻片观察法

1、准备1 ml细胞悬液，用PBS(-)等合适的培养基^a)调整细胞浓度至约10⁷个／ml。

2、取30 μl细胞悬液至试管中，加入10 μl浓度为20 μM的CFSE工作液（终浓度为5μM），轻轻搅拌混匀^b)。

3、在37 ℃培养箱中培养15-30分钟。

4、滴10 μl的细胞悬液在载玻片上，用荧光显微镜观察，看到荧光后，根据自己实验的要求调整细胞数量^C)进行实验。

＊如果背景高的话，第3步之后需要洗去多余的CFSE：

离心后去上清，加入90 μl PBS溶液，再离心后去上清，重复此操作一次。

a)尽可能用不含血清的培养基，血清中的酶和蛋白质会分解CFSE，可能会影响染色效果。

b)如果荧光强度弱，可以适当提高CFSE的终浓度。如果细胞毒性大或背景太高，可以适当降低CFSE的终浓度，请摸索条件找到最佳浓度。

c)根据不同的实验目的和要求，采用稀释的方法调整细胞数量。

Cellstain- CFSE试剂货号：C375

文献

1) M. Bronner-Fraser, “Alterations in Neural Crest Migration by a Monoclonal Antibody That Affects Cell Adhesion”, J. Cell Biol., 1985, 101, 610.

2) A. Nose and M. Takeichi, “A Novel Cadherin Cell Adhesion Molecule:Its Expression Patterns Associated WithImplantation and Organogenesis of Mouse Embryos”, J. Cell Biol., 1986, 103, 2649.

3) S. A. Weston and C. R. Parish, “New Fluorescent Dyes for Lymphocyte Migration Studies Analysis by Flow Cytometry and Fluorescent Microscopy”, J. Immunol. Methods, 1990, 133, 87.

4) C. K. Raymond, P. J. O’hara, G. Eichinger, J. H. Rothman and T. H. Stevens, “Molecular Analysis of the Yeast VPS3 Gene and the Role of Its Product in Vacuolar Protein Sorting and Vacuolar Segregation during the Cell Cycle”, J. Cell Biol., 1990, 111, 877.

5) G. Radcliff, R. Waite, J. Lefevre, M. D. Poulik and D. M. Callewaert, “Quantification of Effector/Target Conjugation Involving Natural Killer(NK) or Lymphokine Activated Killer(LAK) Cells by Two-color Flow Cytometry”, J. Immunol. Methods, 1991, 139, 281.

6) S. A. Weston and C. R. Parish, “Calcein: a Novel Marker for Lymphocytes Which Enter Lymph Nodes”, Cytometry, 1992, 13, 739.

7) L. S. D. Clerck, C. H. Bridts, A. M. Mertens, M. M. Moens and W. J. Stevens, “Use of Fluorescent Dyes in the Determination of Adherence of Human Leucocytes to Endothelial Cells and the Effects of Fluorochromes on Cellular Function”, J. Immunol. Methods, 1994, 172, 115.

常见问题Q&A

Q1 请告诉我如何使用CFSE。

A1：参考文献[1]中的描述如下所示。

杀死7-10周大的CBA / H小鼠，去除脾脏（或其他目标器官），然后浸入F15培养基（1％FCS）中。

然后，通过金属网获得细胞悬液，并通过离心除去红细胞，死细胞等。

将纯化的淋巴细胞悬浮在pH 7.0的PBS中至50,000,000细胞/ mL。

加入5.0μM浓度的CFSE，并在37°C下标记15分钟。悬浮在冰冷却的F15培养基（1％FCS）中并离心

用（350g，5分钟，20℃）洗涤两次。悬浮在F15培养基中。

静脉注射到CBA / H小鼠中。一定时间后，杀死鼠标并去除脾脏（或其他目标器官）。

切除淋巴细胞并分离并通过流式细胞仪分析。

参考文献[2]是关于钙黄绿素-AM的，但也通过与[1]相同的步骤将其与CFSE进行了比较。

【参考文献】

1. Susan A. Weston, Christopher R. Parish, J. Immunol. Methods, 133, 87 (1990).

2. Susan A. Weston, Christopher R. Parish, Cytometry, 13, 739 (1992).

Q2：细胞染料的激发波长和发射波长是多少。

A2：

Cellstain- CFSE试剂货号：C375

Q3:细胞染色试剂Cellstain的哪些活细胞染色染料可以在细胞中长时间停留？

A3: “就细胞内保留而言，“ CFSE”可以在细胞中停留最长时间。尽管荧光强度降低，但是已经证实细胞中存在荧光染料达8周。用“ Calcein-AM”和“ BCECF-AM”观察到荧光达3天。也有报道称“钙蛋白-AM”在6小时内在细胞中保留了90％”

・S.A.Weston, et.al., J.Immunol.Methods, 133, 87-97(1990)

・H.P.Zhong, et.al., Hum.Immunol., 37, 264-270(1993)”

但是，“钙调蛋白-AM”和“ BCECF-AM”对细胞毒活性没有影响。

・L.S.D.Clerck, et.al., J.Immunol.Methods, 172, 115-124(1994)

还要注意的一点是，原始的基本骨架是荧光素，因此由于激发光而褪色由于容易发生，因此可能难以通过长期激发来观察荧光。

（尽管最好使用防褪色剂等）

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