日本同仁化学Rhod 2-AM试剂货号：R002 CAS号： 129787-64-0- DOJINDO

发表于2024年6月19日由whatman中国官网

上海金畔生物科技有限公司代理日本同仁化学 DOJINDO代理商全线产品，欢迎访问官网了解更多信息

Rhod 2-AM试剂货号：R002

1-[2-Amino-5-(3-dimethylamino-6-dimethylammonio-9-xanthenyl)phenoxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid, tetraacetoxymethyl ester, chloride

CAS号： 129787-64-0

商品信息

储存条件：-20度保存，避光

运输条件：室温

分子式：

C₅₂H₅₉ClN₄O₁₉

分子量：

1079.49

特点：

● 激发光557nm，发射光581nm

● 红色荧光与罗丹明相似

● 定位准确，信号强度高

宣传资料

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选择规格：

1 mg

现货

钙离子检测方案

产品性状

产品概述

原理

激发发射波长

溶解比例

注意事项

参考文献

Q&A

产品性状

规格

性状：本产品为暗紫色固体，使用时将固体溶解于无水DMSO中

纯度（HPLC）: 98%以上

荧光光谱图：符合实验要求

NMR光谱图：符合实验要求

处理条件

保存方法：避光冷冻

产品概述

在所有的钙离子指示剂中，Rhod 2荧光信号的波长最长。它具有和罗丹明类似的激发和发射波长，分别为557 nm和581 nm。这样的激发波长使得我们很容易就能找到氩和氪光源的激光。尽管有人认为Rhod 2的荧光信号仅仅将钙复合物的荧光增加了数倍，但是Dojindo的Rhod 2由于具有很高的纯度，能有效地将钙荧光信号增加80-100倍左右，使得它的信号强度在所有的钙离子探针里面是最强的。所以，我们强烈建议使用Rhod 2作为探针用激光显微镜来检测细胞内的钙离子情况。有报道称，特别是在神经组织切片培养方面Rhod 2具有定位点的轮廓线更加清晰的特点。Rhod 2和钙离子的解离常数为（Kd＝1.0 mM），在所有的钙离子荧光探针中是最高的，为监测钙离子浓度提供了一个广阔的范围。Rhod 2-AM是一种Rhod 2的乙酰甲酯衍生物，能非常容易的通过AM法负载到细胞内。

原理

与其他探针一样，Rhod 2-AM是将四个羧基全部作为脂溶性乙基甲酯体的细胞膜透明性物质。可以很容易地被细胞吸收。通过细胞内的脂肪酶水解成为Rhod 2，可以检测细胞内Ca²⁺。

激发发射波长

E x ：557 nm

Em： 581 nm

溶解比例

溶解比例：1mg/ml（DMSO)，50mg/ml（三氯甲烷）

注意事项

1、试剂容易吸潮，从冰箱取出后，请确认在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂极其微量，

开封前，请轻弹管壁几次，以保证粉末落入管底。

2、第一次使用时, 建议母液即配即用。试剂溶解后尽可能在短时间内使用，以保证实验效果。

3、溶解液 DMSO 需要保证新鲜无水，否则将会导致 AM 体水解，荧光染料无法进入细胞影响实验效果。

4、母液遇水极易分解，如果不能一次用完，建议分装保存，例如分装成 5 μl/管，用封口膜封口，

并用铝箔纸包裹，放在一个密闭性能好的塑料袋中，并放入一包干燥剂，在≤-20℃密封避光保存。

5、建议您在正式实验前先摸索一下细胞量、钙离子荧光探针的终浓度、培养时间等，找到最佳实验条件

参考文献

1) R. Y. Tsien, “New Calcium Indicators and Buffers with High Selectivity against Magnesium and Protons:　Design, Synthesis, and Properties of Prototype Structures”, Biochemistry, 1980, 19 (11), 2396.

2) R. Y. Tsien, T. Pozzan and T. J. Rink, “Calcium Homeostasis in Intact Lymphocytes: Cytoplasmic Free Calcium Monitored with a New, Intracellularly Trapped Fluorescent Indicator”, J. Cell Biol., 1982, 94, 325.

3) M. B. Feinstein, J. J. Egan, R. I. Sha’afi and J. White, “The Cytoplasmic Concentration of Free Calcium Inplatelets Is Controlled by Stimulators of Cyclic AMP Production (PGD2, PGE1, FORSKOLIN)”, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1983, 113, 598.

4) N. Miyoshi, K. Hara, S. Kimura, K. Nakanishi and M. Fukuda, “A New Method of Determining Intracellular Free Ca2+ Concentration Using Quin　2-fluorescence”, Photochem. Photobiol., 1991, 53 (3), 415.

5)Hao Gu, Yuhui Zhu, Jiawei Yang, Ruixue Jiang, Yuwei Deng, Anshuo Li, Yingjing Fang, Qianju Wu, Honghuan Tu, Haishuang Chang, Jin Wen, Xinquan Jiang,”Liver-Inspired Polyetherketoneketone Scaffolds Simulate Regenerative Signals and Mobilize Anti-Inflammatory Reserves to Reprogram Macrophage Metabolism for Boosted Osteoporotic Osseointegration.Advanced Science”，2023, Advanced Science, doi：10.1002/advs.202302136

Q&A

Q1: 细胞内检测钙离子的试剂种类都有什么，选择什么样的比较好呢？

A1: 根据检测仪器和检测波长有很多的选择，产品后面标有AM的试剂是可以通过细胞膜的

有很多种相似的试剂，其特点如下：

【Fura 2】

•双波长激发

激发(λex= Ca:340 nm, Ca free:380 nm)、发射：λem=500 nm

•解离常数：224 nmol/L

•因为是荧光强度的比值、可以有效的减小误差

=>細胞内Ca浓度计算。

•该试剂被使用的最多

•必须要更换过滤片、会耽误一些时间。

【Fluo 3】

•单波长激发

激发：λex=508 nm、发射：λem=527 nm

•解离常数：400 nmol/L

•因为激发光在长波段，所以对细胞的损伤比较小

（不会受到NADH、NADPH的影响）

•可以使用Ar激光激发装置。

•不适合切片中钙离子的检测

•【Fluo 4】

•单波长激发

•激发：λex=495 nm、发射：λem=518 nm

•解离常数：360 nmol/L

•与Fluo3相比对荧光强度更高。

•因为激发光在长波段，所以对细胞的损伤比较小

•（不会受到NADH、NADPH的影响）

•可以使用Ar激光激发装置。 •与Fluo3相比对細胞的毒性低

•【Indo 1】

•单波长激发

•激发：λex= 330 nm、发射(λem= Ca:410 nm, Ca free:485 nm)

•解离常数：250 nmol/L

•由于不需要更换滤光片，可以很快地检测细胞内钙离子浓度变化以及像心肌细胞运动中钙离子的变化

•（需要两台检测仪器）

•【Rhod 2】

•单波长激发

•激发：λex=553 nm、发射：λem=576 nm

•解离常数：1.0 μmol/L

•因为激发光在长波段，所以对细胞的损伤比较小

•（不会受到NADH、NADPH的影响）

•可以使用Ar激光激发装置。

•【Quin 2】

•单波长激发

•激发：λex=339 nm、发射：λem=492 nm

•解离常数：110 nmol/L

•最早开发的产品

日本同仁化学Quin 2试剂货号：Q001 CAS号：73630-23-6- DOJINDO

发表于2024年6月19日由whatman中国官网

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Quin 2试剂货号：Q001

8-Amino-2-[(2-amino-5-methylphenoxy)methyl]-6-methoxyquinoline-N,N,N’,N’-tetraacetic acid, tetrapotassium salt

CAS号：73630-23-6

商品信息

储存条件：室温

运输条件：室温

分子式：

C₂₆H₂₃K₄N₃O₁₀

分子量：

693.87

特点：

● 激发波长339nm，发射波长492nm

● 能够轻易的穿过细胞膜

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选择规格：

50 mg

期货

钙离子检测方案

产品性状

产品概述

原理

激发发射波长

溶解比例

注意事项

文献

Q&A

产品性状

规格

性状：本产品为淡黄色粉末，可溶于水

纯度（HPLC）: 95%以上

摩尔吸光系数： 34,000 以上(240 nm附近)

水溶性：符合要求

处理条件

保存方法：避光，常温

产品概述

Quin 2能够和钙（logKCaY=7.1）形成稳定的荧光螯合物，但和镁却不行（logMgY=2.7）。这种螯合物在525 nm的发射波长处有着很高的量子产量（0.14），Quin 2的激发波长为339 nm，发射波长为492 nm。Quin 2-AM是Quin 2的乙酰甲酯衍生物，能够轻易地穿过细胞膜。进入细胞后，酯结构立刻被水解，形成Quin 2。

原理

激发发射波长

E x ：339 nm

Em： 492 nm

溶解比例

溶解比例：84 mg/100 mL（水）

注意事项

1、试剂容易吸潮，从冰箱取出后，请确认在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂极其微量，开封前，请轻弹管壁几次，以保证粉末落入管底。

2、第一次使用时, 建议母液即配即用。试剂溶解后尽可能在短时间内使用，以保证实验效果。

3、溶解液 DMSO 需要保证新鲜无水，否则将会导致 AM 体水解，使荧光染料无法进入细胞，影响实验效果。

4、母液遇水极易分解，如果不能一次用完建议分装保存，例如分装成 5 μl/管，用封口膜封口，并用铝箔纸包裹，放在一个密闭性能好的塑料袋中，并放入一包干燥剂，在≤-20℃密封避光保存。

5、建议您在正式实验前先摸索一下细胞量、钙离子荧光探针的终浓度、培养时间等，找到最佳实验条件

文献

Q&A

Q1: 细胞内检测钙离子的试剂种类都有什么，选择什么样的比较好呢？

A1: 根据检测仪器和检测波长有很多的选择，产品后面标有AM的试剂是可以通过细胞膜的

有很多种相似的试剂，其特点如下：

【Fura 2】

•双波长激发

激发(λex= Ca:340 nm, Ca free:380 nm)、发射：λem=500 nm

•解离常数：224 nmol/L

•因为是荧光强度的比值、可以有效的减小误差

=>細胞内Ca浓度计算。

•该试剂被使用的最多

•必须要更换过滤片、会耽误一些时间。

【Fluo 3】

•单波长激发

激发：λex=508 nm、发射：λem=527 nm

•解离常数：400 nmol/L

•因为激发光在长波段，所以对细胞的损伤比较小

（不会受到NADH、NADPH的影响）

•可以使用Ar激光激发装置。

•不适合切片中钙离子的检测

•【Fluo 4】

•单波长激发

•激发：λex=495 nm、发射：λem=518 nm

•解离常数：360 nmol/L

•与Fluo3相比对荧光强度更高。

•因为激发光在长波段，所以对细胞的损伤比较小

•（不会受到NADH、NADPH的影响）

•可以使用Ar激光激发装置。 •与Fluo3相比对細胞的毒性低

•【Indo 1】

•单波长激发

•激发：λex= 330 nm、发射(λem= Ca:410 nm, Ca free:485 nm)

•解离常数：250 nmol/L

•由于不需要更换滤光片，可以很快地检测细胞内钙离子浓度变化以及像心肌细胞运动中钙离子的变化

•（需要两台检测仪器）

•【Rhod 2】

•单波长激发

•激发：λex=553 nm、发射：λem=576 nm

•解离常数：1.0 μmol/L

•因为激发光在长波段，所以对细胞的损伤比较小

•（不会受到NADH、NADPH的影响）

•可以使用Ar激光激发装置。

•【Quin 2】

•单波长激发

•激发：λex=339 nm、发射：λem=492 nm

•解离常数：110 nmol/L

•最早开发的产品

日本同仁化学Fluo 4-AM试剂货号：F311 CAS号：273221-67-3- DOJINDO

发表于2024年6月19日由whatman中国官网

上海金畔生物科技有限公司代理日本同仁化学 DOJINDO代理商全线产品，欢迎访问官网了解更多信息

Fluo 4-AM试剂货号：F311

1-[2-Amino-5-(2,7-difluoro-6-acetoxymethoxy-3-oxo-9-xanthenyl)phenoxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid, tetra(acetoxymethyl)ester

CAS号：273221-67-3

商品信息

储存条件：-20度保存，避光

运输条件：室温

分子式：

C₅₁H₅₀F₂N₂O₂₃

分子量：

1096.94

特点：

● 激发波长494 nm，发射波长516 nm

● 激光共聚焦，流式细胞仪均可检测

● 荧光强度高

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选择规格：

1mg

现货

钙离子

产品性状

产品概述

原理

激发发射波长

操作步骤

注意事项

数据处理

文献

Q&A

产品性状

规格

性状：本产品为橙红色粉末，使用时将固体溶解于无水DMSO中

纯度（HPLC）: 98%以上

荧光光谱图：符合实验要求

NMR光谱图：符合实验要求

处理条件

保存方法：避光冷冻

产品概述

Fluo 4是一种将Fluo 3结构中的Cl替换成F的钙荧光探针。由于将Cl替换成了电子吸引力更强的F，它的最大激发波长会向短波长处偏离10 nm左右。这个波长更接近于氩激光器的波长，所以用氩激光器激发时，Fluo 4的荧光强度比Fluo 3强1倍。

原理

Fluo 4-AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料,需用无水DMSO配制。Fluo 4-AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo 4，从而被滞留在细胞内。产生的Fluo 4随后会和钙离子(Ca2+)结合并发出荧光。由于Fluo 4与钙离子的亲和力和Fluo 3近似(Fluo 3:Kd=0.4 μmol／l、Fluo 4: Kd=0.36 μmol／l)，所以使用上和Fluo 3也基本相同，可以使用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪等仪器检测细胞内钙离子浓度的变化。钙离子探针种类繁多，根据不同的实验要求，选择不同的产品。

激发发射波长

E x ：494 nm

E m ：516 nm

操作步骤

1、用 HBSS 溶液稀释 1-5 mmol/l 的 Fluo 4-AM 母液，配制成 1-5 µmol/l 的 Fluo 4-AM 工作液。

（此浓度仅供参考，请根据具体实验要求自行调整）

例如:1 mmol/l 母液配制 1 ml 浓度为 5 µmol/l 工作液的方法：用 1 ml HBSS 溶液稀释 5 µl 母

液即可。Fluo 4-AM 工作液需要即配即用，请勿反复冻存。如果Fluo 4-AM进入细胞的效果不好，可

使用Pluronic^® F-127，后者可以防止Fluo 4-AM在缓冲液里聚合并能促进其进入细胞。

*Pluronic^® F-127 先用DMSO溶解至浓度为 20%（W/V），然后根据实验需要直接加入Fluo 4-AM工作

液中至终浓度为 0.04-0.05%（此浓度仅供参考，请根据具体实验要求自行调整）。

2、取出预培养的细胞，除去培养基，使用 HBSS 溶液洗涤细胞 3 次。如果使用含血清的培养基，血清中

的酯酶会分解 AM 体，从而降低 Fluo 4-AM 进入细胞的效果。另外含有酚红的培养基会使本底值略

微偏高，所以加工作液之前需尽量去除培养基残留。

3、加入 Fluo 4-AM 工作液，溶液量以覆盖细胞为准。

4、37℃细胞培养箱孵育 10-60 分钟，除去 Fluo 4-AM 工作液。关于孵育的时间，如果首次做实验不能

确定，建议先孵育 30 分钟，看荧光效果：如果细胞死亡较多，适当缩短时间；如果荧光强度太

弱，适当延长时间。

5、用 HBSS溶液洗涤细胞 3 次，以充分去除残留的 Fluo 4-AM 工作液。然后加入 HBSS 溶液覆盖细胞。

6、37℃培养箱孵育约 20-30 分钟，以确保 AM 体在细胞内的完全去酯化作用。

如果细胞内酯酶活性较低，建议严格按照此操作进行；酯酶活性高的细胞实验，可以忽略此步。

7、用激光共聚焦或荧光显微镜检测细胞，激发波长 494 nm，发射波长 516 nm。

注意事项

1、试剂容易吸潮，从冰箱取出后，请确认在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂极其微量，

开封前，请轻弹管壁几次，以保证粉末落入管底。

2、第一次使用时, 建议母液即配即用。试剂溶解后尽可能在短时间内使用，以保证实验效果。

3、溶解液DMSO需要保证新鲜无水，否则将会导致 AM 体水解，使荧光染料无法进入细胞，影响实验效果

4、母液遇水极易分解，如果不能一次用完，建议分装保存，例如分装成 5 μl/管，用封口膜封口，

并用铝箔纸包裹，放在一个密闭性能好的塑料袋中，并放入一包干燥剂，在≤-20℃密封避光保存。

5、建议您在正式实验前先摸索一下细胞量、钙离子荧光探针的终浓度、培养时间等，找到最佳实验条件

数据处理

计算公式：

[Ca²⁺]i = Kd×(F-F_min) / (F_max-F)

[Ca²⁺]i ：细胞内Ca²⁺浓度

Kd：解离常数

F ：荧光强度

F_min：Ca²⁺为零状态下测得的荧光比值

F_max：Ca²⁺为饱和状态下测得的荧光比值

文献

1) A. Minta, J. P. Y. Kao and R. Y. Tsien, “Fluorescent Indicators for Cytosolic Calcium Based on Rhodamine and Fluorescein Chromophores”, J. Biol. Chem., 1989, 264(14), 8171.

2) J. P. Kao, A. T. Harootunian and R. Y. Tsien, “Photochemically Generated Cytosolic Calcium Pulses and Their Detection by Fluo-3”, J. Biol. Chem., 1989, 264, 8179.

3) M. Eberhard and P. Erne, “Kinetics of Calcium Binding to Fluo-3 by Stopped-Flow Fluorescence”, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1989, 163, 309.

4) A. Hernandez-Cruz, F. Sala and P. R. Adams, “Subcellular Calcium Transients Visualized by Confocal Microscopy in a Voltage-clamped Vertebrate Neuron”, Science, 1990, 247, 858.

5) A. H. Cornell-Bell, S. M. Finkbeiner, M. S. Cooper and S. J. Smith, “Glutamate Induces Calcium Waves in Cultured Astrocytes: Long-Range Glial Signaling”, Science, 1990, 247, 470.

6) D. A. Williams, “Quantitative Intracellular Calcium Imaging with Laser-scanning Confocal Microscopy”, Cell Calcium, 1990, 11, 589.

7) D. A. Williams, S. H. Cody, C. A. Gehring, R. W. Parish and P. J. Harris, “Confocal Imaging of Ionised Calcium in Living Plant Cells”, Cell Calcium, 1990, 11, 291.

8) P. A. Vandenberghe and J. L. Ceuppens, “Flow Cytometric Measurement of Cytoplasmic Free Calcium in Human Peripheral Blood T Lymphocytes with Fluo-3, A New Fluorescent Calcium Indicator”, J. Immunol. Methods, 1990, 127, 197.

10) M. Iino, H. Kasai and T. Yamazawa, “Visualization of Neural Control of Intracellular Ca2+ Concentration in Single Vascular Smooth Muscle Cells in situ”, EMBO J., 1994, 13 (21), 5026.

11) M. E. Dailey and S. J. Smith, “Spontaneous Ca2+ Transients in Developing Hippocampal Pyramidal Cells”, J. Neurobiol., 1994, 25(3), 243.

12) M. Burnier, G. Centeno, E. Burki and H. R. Brunner, “Confocal Microscopy to Analyze Cytosolic and Nuclear Calcium in Cultured Vascular Cells”, Am. J. Physiol., 1994, 266, C1118.

13) E. Donnadieu and L. Y. W. Bourguignon, “Ca2+ Signaling in Endothelial Cells Stimulated by Bradykinin: Ca2+ Measurement in the Mitochondria and the Cytosol by Confocal Microscopy”, Cell Calcium, 1996, 20 (1), 53.

14) M. Ikeda, H. Ariyoshi, J. Kambayashi, K. Fujitani, N. Shinoki, M. Sakon, T. Kawasaki and M. Monden, “Separate Analysis of Nuclear and Cytosolic Ca2+ Concentrations in Human Umbilical Vein Endothelial Cells”, J. Cell. Biochem., 1996, 63 (1), 23.

15) J. E. Merritt, S. A. McCarthy, M. P. A. Davies and K. E. Moores, “Use of fluo-3 to Measure Cytosolic Ca2+ in Platelets and Neutrophils Loading Cells with the Dye, Calibration of Traces, Measurements in the Presence of Plasma, and Buffering of Cytosolic Ca2+”, Biochem. J., 1990, 269, 513.

Q&A

Q1: 细胞内检测钙离子的试剂种类都有什么，选择什么样的比较好呢？

A1: 根据检测仪器和检测波长有很多的选择，产品后面标有AM的试剂是可以通过细胞膜的

有很多种相似的试剂，其特点如下：

【Fura 2】

•双波长激发

激发(λex= Ca:340 nm, Ca free:380 nm)、发射：λem=500 nm

•解离常数：224 nmol/L

•因为是荧光强度的比值、可以有效的减小误差

=>細胞内Ca浓度计算。

•该试剂被使用的最多

•必须要更换过滤片、会耽误一些时间。

【Fluo 3】

•单波长激发

激发：λex=508 nm、发射：λem=527 nm

•解离常数：400 nmol/L

•因为激发光在长波段，所以对细胞的损伤比较小

（不会受到NADH、NADPH的影响）

•可以使用Ar激光激发装置。

•不适合切片中钙离子的检测

•【Fluo 4】

•单波长激发

•激发：λex=495 nm、发射：λem=518 nm

•解离常数：360 nmol/L

•与Fluo3相比对荧光强度更高。

•因为激发光在长波段，所以对细胞的损伤比较小

•（不会受到NADH、NADPH的影响）

•可以使用Ar激光激发装置。 •与Fluo3相比对細胞的毒性低

•【Indo 1】

•单波长激发

•激发：λex= 330 nm、发射(λem= Ca:410 nm, Ca free:485 nm)

•解离常数：250 nmol/L

•由于不需要更换滤光片，可以很快地检测细胞内钙离子浓度变化以及像心肌细胞运动中钙离子的变化

•（需要两台检测仪器）

•【Rhod 2】

•单波长激发

•激发：λex=553 nm、发射：λem=576 nm

•解离常数：1.0 μmol/L

•因为激发光在长波段，所以对细胞的损伤比较小

•（不会受到NADH、NADPH的影响）

•可以使用Ar激光激发装置。

•【Quin 2】

•单波长激发

•激发：λex=339 nm、发射：λem=492 nm

•解离常数：110 nmol/L

•最早开发的产品

日本同仁化学Fluo 4-AM special packaging试剂货号：F312 CAS号：273221-67-3- DOJINDO

发表于2024年6月19日由whatman中国官网

上海金畔生物科技有限公司代理日本同仁化学 DOJINDO代理商全线产品，欢迎访问官网了解更多信息

Fluo 4-AM special packaging试剂货号：F312

1-[2-Amino-5-(2,7-difluoro-6-acetoxymethoxy-3-oxo-9-xanthenyl)phenoxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid, tetra(acetoxymethyl)ester

CAS号：273221-67-3

商品信息

储存条件：-20度保存，避光

运输条件：室温

分子式：

C₅₁H₅₀F₂N₂O₂₃

分子量：

1096.94

特点：

● 激发波长494 nm，发射波长516 nm

● 激光共聚焦，流式细胞仪均可检测

● 荧光强度高

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选择规格：

50ug

50ug*8

现货

钙离子

Fluo 4-AM special packaging试剂货号：F312 CAS号：273221-67-3

活动进行中

产品性状

产品概述

原理

激发发射波长

操作步骤

注意事项

数据处理

文献

Q&A

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产品性状

规格

性状：本产品为橙红色粉末，使用时将固体溶解于无水DMSO中

纯度（HPLC）: 98%以上

荧光光谱图：符合实验要求

NMR光谱图：符合实验要求

处理条件

保存方法：避光冷冻

产品概述

原理

Fluo 4-AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料,需用无水DMSO配制。Fluo 4-AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo 4，从而被滞留在细胞内。产生的Fluo 4随后会和钙离子(Ca²⁺)结合并发出荧光。由于Fluo 4与钙离子的亲和力和Fluo 3近似(Fluo 3:Kd=0.4 μmol／l、Fluo 4: Kd=0.36 μmol／l)，所以使用上和Fluo 3也基本相同，可以使用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪等仪器检测细胞内钙离子浓度的变化。钙离子探针种类繁多，根据不同的实验要求，选择不同的产品。

激发发射波长

E x ：494 nm

E m ：516 nm

操作步骤

1、用 HBSS 溶液稀释 1-5 mmol/l 的 Fluo 4-AM 母液，配制成 1-5 µmol/l 的 Fluo 4-AM 工作液。

（此浓度仅供参考，请根据具体实验要求自行调整）

例如:1 mmol/l 母液配制 1 ml 浓度为 5 µmol/l 工作液的方法：用 1 ml HBSS 溶液稀释 5 µl 母

液即可。Fluo 4-AM 工作液需要即配即用，请勿反复冻存。如果Fluo 4-AM进入细胞的效果不好，可

使用Pluronic^® F-127，后者可以防止Fluo 4-AM在缓冲液里聚合并能促进其进入细胞。

*Pluronic^® F-127 先用DMSO溶解至浓度为 20%（W/V），然后根据实验需要直接加入Fluo 4-AM工作

液中至终浓度为 0.04-0.05%（此浓度仅供参考，请根据具体实验要求自行调整）。

2、取出预培养的细胞，除去培养基，使用 HBSS 溶液洗涤细胞 3 次。如果使用含血清的培养基，血清中

的酯酶会分解 AM 体，从而降低 Fluo 4-AM 进入细胞的效果。另外含有酚红的培养基会使本底值略

微偏高，所以加工作液之前需尽量去除培养基残留。

3、加入 Fluo 4-AM 工作液，溶液量以覆盖细胞为准。

4、37℃细胞培养箱孵育 10-60 分钟，除去 Fluo 4-AM 工作液。关于孵育的时间，如果首次做实验不能

确定，建议先孵育30分钟看荧光效果：如果细胞死亡较多，适当缩短时间；如果荧光强度太弱，

适当延长时间。

5、用 HBSS溶液洗涤细胞 3 次，以充分去除残留的 Fluo 4-AM 工作液。然后加入 HBSS 溶液覆盖细胞。

6、37℃培养箱孵育约 20-30 分钟，以确保 AM 体在细胞内的完全去酯化作用。

如果细胞内酯酶活性较低，建议严格按照此操作进行；酯酶活性高的细胞实验，可以忽略此步。

7、用激光共聚焦或荧光显微镜检测细胞，激发波长 494 nm，发射波长 516 nm。

注意事项

1、试剂容易吸潮，从冰箱取出后，请确认在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂极其微量，

开封前，请轻弹管壁几次，以保证粉末落入管底。

2、第一次使用时, 建议母液即配即用。试剂溶解后尽可能在短时间内使用，以保证实验效果。

3、溶解液DMSO需要保证新鲜无水，否则将会导致 AM 体水解，使荧光染料无法进入细胞，影响实验效果

4、母液遇水极易分解，如果不能一次用完，建议分装保存，例如分装成 5 μl/管，用封口膜封口，

并用铝箔纸包裹，放在一个密闭性能好的塑料袋中，并放入一包干燥剂，在≤-20℃密封避光保存。

5、建议您在正式实验前先摸索一下细胞量、钙离子荧光探针的终浓度、培养时间等，找到最佳实验条件

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