足够用于:800 cm2 膜(10 微型凝胶印迹) • 稳定链霉su亲和素-HRP,1.5 mL • 鲁米诺/增强剂溶液,80 mL • 稳定的过氧hua氢溶液,80 mL • 封闭缓冲液(产品编号 89880A),500 mL • 洗涤缓冲液 (4X),500 mL • 底物平衡缓冲液,500 mL
LightShift EMSA 检测的原理类似于 Western 印迹。生物su末端标记的双螺旋 DNA 与细胞核提取物或纯化因子一起孵育并在天然凝胶上电泳。然后快速(30 分钟)将 DNA 转印到阳性尼龙膜上,进行紫外交联,用链霉su亲和素-HRP 偶联物进行探测,并与底物一起孵育。可在一天内完成从标记到得出结果。
蛋白与 DNA 的相互作用是控制许多细胞过程的关键,包括 DNA 复制、重组和修复、转录和病毒组装。研究基因调控和确定蛋白:DNA 相互作用的核心技术是电泳迁移率实验 (EMSA)。
EMSA 技术基于以下观察结果:在进行非变性聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳时,蛋白:DNA 复合物的迁移速度比无 DNA 分子慢。因为 DNA 迁移率会根据蛋白结合率发生偏移或速度减慢,因此,该实验也被称为凝胶偏移或凝胶延迟实验。直至 EMSA 蛋白:DNA 相互作用主要通过硝酸纤维素过滤柱结合试验进行研究。
Co-IP 是研究蛋白:蛋白相互作用的常用方法,其使用抗体对抗原(诱饵蛋白)进行免疫沉淀,对任何相互作用蛋白(猎物蛋白)进行免疫共沉淀。使用蛋白 A 或 G 的传统 co-IP 方法可导致抗体重链和轻链的共洗脱,而这些重链和轻链可能与相关条带共迁移,掩盖了重要的结果。Pierce Co-IP 试剂盒通过将抗体共价偶联至胺反应性树脂上,解决了该问题。该试剂盒包含用于蛋白结合和回收的优化缓冲液、进行对照实验所需的试剂以及高效离心柱和收集管,可缩短方案并尽量减少操作和混合。
免疫共沉淀试剂盒的特点:
•适用于任何纯化抗体—使用任何纯化抗体进行 co-IP 实验,无论物种或 Ig 类别(鸡 IgY、人 IgE、小鼠 IgG1、IgM 等)如何;不依赖蛋白 A 和蛋白 G 的亲和结合 • 无抗体干扰—共价结合方法和非还原洗脱系统可以产生纯 co-IP 产品,该产品不会被 IP 抗体污染 • 可重复使用的抗体微珠—共价抗体固定化允许重复使用制备的 IP 树脂,并可能节省昂贵抗体 • 全套试剂盒—所有用于抗体固定和许多 IP 实验的试剂,包括结合和洗涤缓冲液、洗脱缓冲液和便利的微量离心柱,使树脂操作更加简单和高效。 •随附对照微珠—提供未衍生化琼脂糖微珠,用作非特异性结合的阴性对照 • 通用—co-IP 方法与任何生理(非变性)蛋白样品缓冲液兼容,缓冲液与特异性抗体抗原和蛋白相互作用复合物兼容。
免疫共沉淀 (Co-IP) 是一种用于发现蛋白相互作用的常用体外方法。Pierce 免疫共沉淀试剂盒经过配置,是有效进行 Co-IP 实验的基本工具,能够产生不含棘手的 IP 抗体的纯 IP 和 co-IP 产物。通过使用可直接且永偶联纯 IP 抗体的 AminoLink Plus 树脂替代蛋白 A/G 琼脂糖微珠,对传统 co-IP 技术实现这种改善。温和(非还原、非变性)洗脱缓冲液可实现在保留琼脂糖微珠上固定化抗体的同时解离 IP 靶标。结果是获得一种可通过 Western 印迹(或甚至测序)进行分析的纯产物,无抗体干扰。
除消除 IP 抗体污染外,构成 Pierce Co-IP 试剂盒的抗体偶联方法还可避免传统蛋白 A 和蛋白 G 方法产生的非特异性结合相互作用和浸出污染。尽管偶联方法要求起始抗体包含在不含 BSA、明胶和其他贮藏蛋白稳定剂的无胺缓冲液中,但其不依赖于蛋白 A 或蛋白 G 这一事实意味着任何抗体种类或类别均可用于 IP(例如,IgM 和鸡 IgY)。实际上,任何纯化的蛋白都可以固定化用于结合配偶体的亲和纯化。
ThermoPierce™ 免疫共沉淀试剂盒
规格
检测
亲和纯化
适用于(设备)
微型离心机
形式
试剂盒
产品线
Pierce™
数量
1 个试剂盒
适用于(应用)
免疫沉淀(IP)
Target
无靶标特异性
类型
免疫沉淀试剂盒
足够用于
50 次反应
产品规格
试剂盒
内容与储存
足够用于:准备并进行 50 次 co-IP 反应,每次使用 25 µL 树脂 • AminoLink Plus 偶联树脂,2 mL • 偶联缓冲液 (20X),25 mL • 氰基peng氢化钠溶液 (5M),0.5 mL • 淬灭缓冲液,50 mL • 洗涤液,60 mL • IP 裂解/洗涤缓冲液,2 x 50 mL • 改良 Dulbecco PBS (20X),25 mL • 调节缓冲液 (100X),5 mL • 洗脱缓冲液,50 mL • 泳道标志物样品缓冲液 (5X),5 mL • Pierce 离心柱,螺旋盖,50 根柱 • 微量离心机收集管,2 mL,100 支管 • 微量离心机收集管,1.5 mL,50 支管 • Pierce 对照琼脂糖树脂,2 mL
传统 IP(无共价抗体连接)的抗原得率通常高于使用交联的 IP 方案。这是因为交联过程不可避免地会引起一些功能性抗体结合位点的损失。为了克服交联方法的这一限制,在交联 IP 方法中需要使用的 IP 抗体量可能多于等效传统 IP 程序。当然,交联免疫沉淀程序的优势在于 Western 印迹无干扰抗体条带。
足够用于:进行 40 次 IP 反应(使用 25 µL 微珠) •Pierce 蛋白 A/G 磁珠,1 mL • IP 裂解/洗涤缓冲液,2 x 50 mL • 偶联缓冲液 (20X),25 mL • DSS 交联剂,8 x 2 mg • 泳道标志物样品缓冲液 (5X),5 mL • 洗脱缓冲液,25 mL • 中和缓冲液,1 mL • 泳道标志物样品缓冲液 (5X),5 mL
蛋白 A/G 是一种基因工程化蛋白,结合了蛋白 A 和蛋白 G 的 IgG 结合结构域。该融合蛋白在大肠杆菌中表达。蛋白A/G含有蛋白A的四个Fc结合结构域和蛋白G的两个Fc结合结构域,最终分子量为50,460道尔顿(SDS-PAGE中测得为40至45kDa)。蛋白 A/G 的 pH 值依赖性低于单独的蛋白 A,但具备蛋白 A 和 G 的累加特性。
蛋白 A/G 可与所有的人 IgG 亚类结合,因此是用于纯化尚未确定亚类的多克隆或单克隆 IgG 抗体的理想选择。此外,它还可结合IgA、IgE、IgM和IgD(后者结合力较弱)。蛋白A/G还可与小鼠所有IgG亚类结合,但不结合小鼠IgA、IgM或血清白蛋白。因此,蛋白A/G是纯化和检测小鼠IgG各亚类单克隆抗体的佳绝选择,避免了IgA、IgM和小鼠血清白蛋白的干扰。小鼠单克隆的个别亚类与嵌合蛋白 A/G 的亲和力很可能强于与蛋白 A 或蛋白 G 的亲和力。
Pierce IP 裂解缓冲液由 25 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1% NP-40 和 5% 甘油组成。该缓冲液不含蛋白酶或磷酸酶抑制剂;但是如果需要,可在使用前添加各种抑制剂,如 Thermo Scientific Halt 蛋白酶抑制剂混合物或磷酸酶抑制剂混合物,以防止蛋白水解并保持蛋白磷酸化。