人ES/iPS细胞检测试剂盒

可检测未分化细胞数

rBC2LCN（AiLecS1）来源于Burkholderia cenocepacia，凝集素BC2L-C的N末端域在大肠菌表达的重组蛋白。 　　rBC2LCN对人类ES/ iPS细胞表面足糖萼蛋白的粘蛋白O-型糖链-H-3型（Fucα1-2Galβ1-3GalNAc）具有高亲和性，因此rBC2LCN被认为是可以检测人类ES/ iPS细胞的未分化标志物。 　　通过rBC2LCN把糖蛋白（H-3型聚合足糖萼）从人类ES/iPS细胞表面释放到培养液中。该试剂盒通过rBC2LCN和未分化标记抗体的Sandwich Assay测定法，定量测定从人类ES/iPS细胞表面释放到培养中的糖蛋白数量，进而可推算出人类ES/iPS细胞数。

◆特点

　●　通过对培养上清的分析，监测未分化细胞数的增减。

　●　因其测定对象为培养上清，不会在检查过程中消耗细胞数量，且可在此过程中继续进行细胞培养

　●　少量的培养上清（50μL）即可分析

　●　采用ELISA测定法，可简单快速的处理多样品

　试剂盒构成

◆原理

　●标准曲线制作

　　该试剂盒中未含有绘制标准曲线用的标准品。因此，请按照下述顺序调制标准品后，再行绘制标准曲线：

　　　1.　在未分化维持培养条件下进行人ES/ iPS细胞培养，更换培养基的第二天（18至24小时后）回收培养

　　　　　上清。

　　　2.　细胞剥离，测定人S/ iPS细胞数。

　　　3.　计算出回收到的培养上清中所含的人ES/ iPS细胞数。如：培养基量5mL，测定细胞数为5×10⁶cells

　　　　　时，则回收培养上清中的人ES/ iPS细胞数即为1×10⁶cells/mL。

　　　4.　利用回收的培养上清未分化维持用培养基或已分化培养基，制成已知细胞浓度的稀释系列，以绘制标准

　　　　　曲线。

◆分化诱导时的使用案例

　　　1.　在未分化维持培养时，对人ES/iPS细胞的培养上清进行取样，计算人ES/iPS细胞数。

　　　2.　在分化用培养基中对第1项的培养上清进行稀释，制成稀释系列，以绘制该试剂盒的标准曲线。

　　　3.　使用本试剂盒测定可确认人ES/iPS细胞数的培养上清。

　　　4.　推算分化条件下残存的人ES/iPS细胞数

【细胞株间和培养基间的比较】

　　在各个未分化维持用培养基（培养基A、B、C、D）中分别培养人类iPS细胞201B7株和253G4，更换培养基后第二天回收培养上清。计算细胞数量，用各个未分化维持用培养基将各培养上清稀释至2,000cells/mL，进而测定该试剂盒的吸光度。测定结果如下图所示。结果表明，即使细胞株或培养基等培养条件的细胞数量恒定，信号强度也有差异。因此，必须为培养条件绘制标准曲线。

【人类iPS细胞培养上清的测定】

　　用StemSure^® hPSC培养基培养人类iPS细胞201B7株，更换培养基第二天回收该培养基的培养上清。于此同时，计算细胞数量，阶段性的在StemSure^® hPSC培养基中稀释培养上清，并将稀释后的培养上清用试剂盒检测。结果可得到一个极高相关系数的线性公式。根据这个线性公式求出该培养条件下的人类iPS细胞检测下限值^※为108 cells/mL。

※检测下限值：根据培养基背景吸光度平均值+3.3SD和线性公式计算出来的细胞数量。

【分化细胞培养上清和人类iPS细胞培养上清液混合检测】

　　将含有成纤维细胞和人膝关节软骨（NHAC-kn）细胞的血清培养基上清与人类iPS细胞培养上清混合后，确认能否测定添加在其中的未分化细胞标志物。将iPS细胞混合比例0~20%（0～2×10⁴ cells/mL：总细胞数 1×10⁵ cells/mL）的人iPS细胞培养上清，混合到成纤维细胞和人膝关节软骨细胞培养上清中，用试剂盒检测。在血清和成纤维细胞存在的条件下，可在培养上清中测定出人iPS细胞培养上清。

　　另外还可从成纤维细胞/人膝关节软骨细胞和iPS细胞的混合试验材料中得出一个线性公式，根据该公式可求出人iPS细胞的检测下限值^※，分别为：170 cells/mL和96 cells/mL。

　使用注意项

　　●　由于细胞株、培养基种类等培养条件的不同，会导致信号轻度和细胞数的关系产生差异，所以必须绘制细胞

　　　  株、未分化维持培养条件、分化诱导培养基标准曲线。

　　●　不同培养条件下，不能依靠信号强弱来评定未分化性。未分化性的评定一定要在相同培养条件下进行。

　　●　用该试剂盒测算出来的ES/iPS细胞数与实际细胞数未必一致。对未分化维持状态和进行细胞分化的监控，也

　　　  是需要参考的指标之一。

欲了解更多相关资料请点击文字：无损监测具有致瘤性人ES/iPS细胞的技术

●相关产品

　●荧光标识rBC2LCN
　　添加到人类ES/iPS细胞培养液中，可为人类ES/iPS活细胞染色。

　●rBC2LCN-PE23
　　仅加入含有人类ES/ iPS细胞的培养液中，可以选择性地杀死人类ES/ iPS细胞。

　●rBC2LCN汽提溶液
　　可将与人类ES/ iPS细胞表面糖链聚合起来的rBC2LCN从细胞上剥落下来。rBC2LCN剥落后，细胞还可添加其他抗体进行染色、培养。

　●BC2LCN凝聚素, 重组体、溶液
　　集中未标识的rBC2LCN

　●StemSure®hPSC培养基Δ
　　无饲养层细胞条件下可用于维持培养人类ES/iPS细胞的无血清液态培养基。原料不含动物体成分。

　●StemSure^®系列
　　通过小鼠ES细胞D3株或人类iPS细胞201B7株，进行品质测验。

　●Y-27632, MF
　　该品最为培养基添加物被登记在原药等登录原簿（MF）中。以自主规格为基础，实现原料管理、制造工程和分析实验的有效检验，创建可以恒常稳定产品品质的体制。＜点击此处＞

　●ES・iPS细胞研究用试剂
　　2007年iPS细胞确立发表后，许多与iPS细胞相关的文献纷纷发表。在各种各样的文献中报道出来的与ES细胞・iPS细胞の未分化能维持和分化诱导相关的低分子化合物也逐渐阵容化。＜点击此处＞

　●液态培养基・细胞培养用试剂
　　我们有着以液态培养基为首的平衡盐溶液、细胞剥离·分散液、抗生物质溶液、细胞外基质等丰富的产品种类。＜点击此处＞

Q：　培养上清中会有糖萼蛋白残留吗？

A：　糖萼蛋白会被释放到培养上清中。培养上清在37℃条件下保存8天，信号都不会减弱，因此作为本试剂盒测试

         对象的糖萼蛋白上的糖链在此期间都能保持其稳定性。如果冷冻保存的情况下，糖链安定性可稳定维持4个

         月。（但切记避免反复冻融。）

Q：　糖萼蛋白可作为标准品使用吗？

A：　该试剂盒是用于检测糖萼上的糖链的。因合成附有糖链的蛋白质很困难，所以生产出试剂盒适用的标准品也不

         易。虽然可能可以制作出不带糖链的糖萼蛋白，但是否能够作为标准品就不得而知了。

Q：　释放的足糖萼蛋白长度是恒定的吗？

A：　足糖萼蛋白是氨基酸配列恒定的，分子量为55kDa的蛋白质，但实际上足糖萼蛋白上还附有Ｏ型糖链、N型糖

         链和葡糖胺聚糖，分子量为240kDa以上的大型粘蛋白分子。因是由糖链修饰程度和性质不同的分子群混合起

         来的异质糖蛋白质群，分子量并不是恒定的。电泳分子量＞240kDa。

Q：　在三维细胞培养中，足糖萼蛋白也能释放出来吗？

A：　是的，三维培养中也能释放足糖萼蛋白。

Q：　足糖萼蛋白的作用是什么？

A：　足糖萼蛋白在人类iPS细胞中的机能暂时未知，但和未分化细胞的形态、增值性、分化能等有着密切的关系。

         它是发现肾脏肾小球足细胞的主要糖蛋白，在足细胞形态的形成和足细胞机能中起重作用。足糖萼蛋白缺失

         的小鼠，会引起肾脏异常致死。

Q：　回收培养上清时，是否需要进行混匀？

A：　是的。摇晃孔盘/孔板轻轻混匀后，再进行培养上清的回收。

Q：　阳性对照品和阴性对照品的使用目的是什么？

A：　用以确认试剂盒反应系是否正常进行。

Tateno, H., Onuma, Y., Ito, Y., Hiemori, K., Aiki, Y., Shimizu, M., Higuchi, K., Fukuda, M., Warashina, M., Honda, S., Asashima, M. and Hirabayashi, J.: Sci. Rep., 4, 4069 (2014).

阿尔茨海默病研究用

磷酸化Tau T181 ELISA试剂盒 Wako

本试剂盒可以轻松检测第181位苏氨酸（T181）磷酸化Tau。

Tau是一种与微管相关的蛋白，主要在中枢神经系统的神经元中表达，并调节微管的稳定性。在阿尔茨海默病患者的大脑中，形成了磷酸化的Tau和神经原纤维缠结的聚集体，有报道称其形成程度与痴呆症的严重程度有关。因此，对Tau的研究大部分都与调查阿尔茨海默氏病的病因并开发治疗该疾病的药物相结合。由于阿尔茨海默病患者脑脊液（CSF）中Tau和磷酸化Tau的浓度高于非痴呆症患者，因此测量CSF中Tau和磷酸化Tau的浓度非常重要。 此ELISA是用于检测Tau的高灵敏度试剂盒，其中包括CSF中的磷酸化苏氨酸181（pT181）。

◆特点

●　少量样品即可检测：所需样品量 20 μL

●　灵敏度高：标准曲线范围4.40-500 pg/mL

●　检测结果与不同痴呆阶段之间呈相关性

◆试剂盒组成

◆试剂盒功能

*不可检测血浆，血清样品

**检测需要酶标仪

◆检测原理

该试剂盒是夹心ELISA，它使用了2个单克隆抗体测量磷酸化Tau T181，一个识别磷酸化Tau T181，另一个识别Tau的中间区域。

◆添加回收及稀释度线性实验

◆检痴呆症不同阶段的人体CSF检测

使用本品和其他公司的试剂盒对患者的脑脊液（CSF）进行检测。样本分别来自阿尔茨海默病（AD），轻度认知障碍（MCI）和非痴呆症患者。

红色：由于未检测到或超出标准曲线，因此可靠性较低。

观察到非痴呆症，MCI和阿尔茨海默病之间具有显著差异。

◆Tau pT181浓度与MMSE评分的相关性

MMSE分数（诊断认知功能的测试分数）

30-28正常；27-24怀疑有轻度认知障碍；≦23痴呆症

Tau pT181浓度与MMSE评分之间存在高度相关性。

◆产品列表

◆相关产品

Tau 抗体

Aβ低聚物ELISA试剂盒

Screen-Well ^® 磷酸酶抑制剂 化合物库

Screen-Well ^® Phosphatase Inhibitor library

◆原理

  Enzo Life Sciences提供一系列独一无二的化合物库，包括各类抑制剂、激活剂和诱导剂等各种小分子。随货附送完整的证明书，化合物活性描述、包装规格、化合物浓度含量、物理性状和

◆优点・特色

●   广泛的生产线：超过3000种小分子化合物，包括天然产物，酶抑制剂，受体的配体，药物，脂类&脂肪酸等。

     独特的化合物库，包括：FDA认证化合物库、天然化合物库、化学基因组学和信号通路相关化合物等。

●   新颖性，化学物库是有相关的小分子组成，Enzo申请专利的化合物。

●   简单低成本， 化合物全都溶在相应溶剂中、无需额外溶解步骤，即可进行筛选。

   ●   包含无毒对照品，大量毒性明确且毒性不同的化合物

   ●   96孔板包装，溶于DMSO中，即可进行筛选

◆案例・应用

Screen-Well^® 毒性化合物库

     Screen-Well^® 化合物库可用于心脏毒性、肝脏毒性和造血毒性研究，这些化合物毒性明确、对不同器官有相关毒性证明资料。该库中含有许多结构、机制不同的化合物，且有无毒化合物作为对照。该化合物库在预测毒理学筛选（包括高通量筛选）中非常有用。

Phosphatase inhibitor library

磷酸酶抑制剂化合物库包含33种已知活性的激酶抑制剂。抑制剂溶于DMSO中，终浓度为10mM、有100uL和500uL两种规格。该化合物库可用于化学基因组学、药理分析、多轮化合物筛选等。

抑制剂针对的磷酸酶包括：

PP广口/窄口瓶

　　本品是透明度高、耐热性、耐药性优良的PP广口/窄口瓶。可在高压灭菌器中使用。

◆PP广口瓶产品列表

※各尺寸仅供参考。

◆PP窄口瓶产品列表

◆特点

●　无内盖，减少工作时间。

●　一步即可打开瓶盖，方便工作。

●　主体材料采用了透明度高的聚丙烯。

●　耐酸、耐碱，对于其他一部分溶剂也具有良好的耐药性。

Q：是否含有增塑剂？

A：工艺上没有添加增塑剂，但含有1ppm～5ppm催化剂杂质邻苯二甲酸。

Q：PP广口/窄口瓶的原料等级是无规共聚物、嵌段共聚物还是均聚物？

A：原料等级是均聚物。

Q：广口/窄口瓶的盖子是否有其他颜色？

A：没有。

Q：为什么PP广口/窄口瓶的实际外径有时比说明书上标示的尺寸小呢？

A：因为瓶体（圆柱体）不是正圆柱体，所以会出现尺寸误差。还有可能是由于模塑后发生了轻微的膨胀或收缩，所以测量出的外径比标示的小。

Q：如果运输装有液体的PP广口/窄口瓶，密封性如何？

A：该PP广口/窄口瓶为存放用瓶，我们不能保证其运输性能。但是，在质量（密封性）检测中，往PP广口/窄口瓶中加入水，侧倒放置24小时，没有出现渗漏。（抽样检测）

人iPS细胞·小鼠ES细胞冻存用

StemSure^® 细胞冻存液 Update！！

　　本产品是可用于冻存以小鼠ES细胞为代表的各种通用细胞株的无血清型细胞冻存液。含BSA和10%DMSO 。标准测试中用小鼠ES细胞D3株冻存、复苏，确认其细胞存活率。本产品采用缓慢冻存法冻存细胞，无需使用程序降温盒。

　　使用本产品对小鼠ES细胞D3株在-80℃进行保存，可冻存2年；普通细胞在-150℃下可冻存30个月，并且可维持很高的存活率。

　　另外，本产品已确认可用于冻存人iPS细胞。

◆特点

●  可在维持人iPS细胞、小鼠ES细胞未分化能力的状态下，直接进行冻存。

●  可在-80℃下进行长时间冻存。

●  冻存的通用动物细胞株的细胞存活率好。

●  无血清型

●  无需自行配制试剂

●  无需使用程序降温盒

◆测试项目

●  细胞存活率时间（使用小鼠ES细胞D3株进行实验）

●  无菌实验

●  内毒素实验

●  支原体实验

◆使用方法

人iPS细胞的冻存

1.    冻存

①    去除人iPS细胞培养皿中的营养液，用PBS清洗后，用Accutase等剥离细胞。

②    添加含有10μmol/L Y-27632的人iPS培养基（hPSC培养基（+ROCKi）），用移液器吹打成单细胞。

③    将吹打分散的细胞悬浮液移至样本管，离心（1,000rpm，3min，室温）后去除上清液。

④    添加含hPSC培养基（+ROCKi）的培养基，用移液器悬浮。

⑤    计算细胞数量。

⑥    以1×10⁶clls/管分注在细胞悬浮液保存管中。

⑦    离心（1,000rpm，3min，室温）后去除上清液。

⑧    使用50μL/管本产品进行悬浮，在-80℃下进行冻存。

2.    复苏

①    在冻存管中添加hPSC培养基（+ROCKi），复苏冻结细胞（不使用温水浴法）。

②    离心（1,000rpm，3min，室温）后去除上清，再次添加hPSC培养基（+ROCKi），悬浮。

③    计算细胞数量。

④    在培养皿中按照2×10⁵cells/6cm进行细胞培养。

小鼠ES细胞、通用动物细胞株的冻存

1.    冻存

①    收集细胞至样本管中。

②    离心，去除上清。

③    在样本管中加入本产品，悬浮。

④    分注至悬浮液保存管中。

⑤    将保存管在-80℃冻洁一晚。

⑥    保存于-150℃或-80℃

2.    复苏

①    将冻存管置于37℃的水浴槽中解冻。

②    在培养用的培养基中进行悬浮。

③    离心去除上清后用培养基进行重悬。

④    在培养容器内培养细胞。

◆人iPS细胞201B7细胞系的冻存 Update！！

　　将人iPS细胞201B7株分散为单细胞后，在StemSure^® 冻存液中悬浮，并在-80℃下冻存4天。反复冻结、复苏3次之后，确认细胞存活率和各种未分化标记（Oct3/4、Sox2、SSEA-4、Tra-1-81）的表达。

细胞生存率

未分化标记表达的确认

◆小鼠ES细胞D3细胞系的冻存

-150℃保存（30个月）

-80℃保存（24个月）

<冻存>

①    在1mL本产品中悬浮1~2×10⁶cells，分注至冻存管中。

②    在-80℃冻存1天后转移至-150℃冻存。或者在-80℃冻存。

<复苏>

③    在37℃的温浴槽中复苏。

④    在细胞培养基中悬浮、离心。

⑤    弃上清，用细胞培养基重悬细胞并进行培养。

○确认细胞集落形成

培养细胞数：500个细胞/孔（含胶原蛋白涂层的6孔板）

培养时间：10天

◆冻存通用动物细胞系后的细胞存活率

　　用StemSure^® 细胞冻存液冻存各种动物细胞株。可确认到冻存30个月后仍维持高存活率，且复苏后细胞可移植。

<冻存>

①    在1mL本品中悬浮1~2×10⁶cells，分注至冻存管中。

②    在-80℃冻存1天后转移至-150℃分别冻存2个月、4个月、30个月。

<复苏>

③    在37℃的水浴槽中复苏。

④    细胞培养用培养基中悬浮、离心。

★其他冻存液★

◆相关产品

★StemSure^® 系列★

　　本系列产品适用于培养ES细胞和iPS细胞。每个批次产品都适用小鼠ES细胞D3细胞系进行品质实验检测。

★rBC2LCN-FITC★

　　rBC2LCN可特异性识别未分化的人ES/iPS细胞。将本产品添加至含有人ES/iPS细胞的培养液中，可对活性状态下的未分化细胞进行染色。<详情>

★液体培养基·细胞培养用试剂★

　　Wako充分准备了以液体培养基为代表的平衡盐溶液、细胞分离·分散用溶液、抗生物素溶液、细胞外基质等产品。<详情>

★ES·iPS细胞研究用试剂★

　　2007年iPS细胞树突发表后，许多与iPS细胞有关的文献被发表出来。Wako推出了在各个文献中都有所报道的与维持ES细胞·iPS细胞的未分化能和分化诱导相关的低分子化合物。<PDF下载>

★LIF，人，重组体，培养上清★

　　LIF具有抑制小鼠ES细胞分化的作用，因此可在培养细胞时，用来维持ES细胞的未分化状态。<详情>

无动物源成分的干细胞冻存液，请点击：StemSure^® hPSC冻存液, AF

抗精神病药成分

◆吩噻嗪类化合物

盐酸氯丙嗪（Chlorpromazine Hydrochloride）

CAS No. 69-09-0 C17H19ClN2S・HCl=355.33 纯度:99.0+％（Titration） 可溶性溶剂:水 保存条件:冷藏 用途（作用）:吩噻嗪类化合物。对多巴胺D2受体有阻断作用。

马来酸甲氧异丁嗪（Levomepromazine Maleate）

CAS No. 7104-38-3 C19H24N2OS・C4H4O4=444.54 纯度:90.0+％（HPLC） 可溶性溶剂:甲醇 保存条件: 用途（作用）:吩噻嗪类化合物。对多巴胺D2受体有阻断作用。

◆丁酰苯类化合物

氟哌啶醇（Haloperidol）

CAS No. 52-86-8 C21H23ClFNO2=375.86 纯度:98.0+％（Titration） 可溶性溶剂:氯仿 用途（作用）:丁酰苯类化合物。对多巴胺D2受体有阻断作用。

哌迷清（Pimozide）

CAS No. 2062-78-4 C28H29F2N3O=461.55 纯度:99+％ 可溶性溶剂:DMSO 用途（作用）:丁酰苯类化合物。对多巴胺D2受体有阻断作用。

◆苯异恶唑衍生化合物

税司哌酮（Risperidone）

CAS No. 106266-06-2 C23H27FN4O2=410.48 可溶性溶剂:甲醇 用途（作用）:苯异恶唑衍生物。对多巴胺D2受体和羟色胺-5HT2有拮抗作用。

盐酸哌罗匹隆二水合物（Perospirone Hydrochloride Dihydrate）

CAS No. 192052-81-6 C23H30N4O2S・HCl・2H2O=499.07 纯度:98.0+％（HPLC） 可溶性溶剂:水 用途（作用）:苯异恶唑衍生物。对多巴胺D2受体和羟色胺-5HT2有拮抗作用。

◆多元受体标靶精神药类化合物

奥氮平（Olanzapine）

CAS No. 132539-06-1 C17H20N4S=312.43 纯度:98.0+％（HPLC） 可溶性溶剂:乙腈 用途（作用）:对多巴胺、羟色胺为首的多数神经物质受体都有拮抗作用。

富马酸奎硫平（Quetiapine Fumarate）

CAS No. 111974-72-2 （C21H25N3O2S）2・C4H4O4=883.09 纯度:98.0+％（HPLC） 可溶性溶剂:N,N-二甲基甲酰胺 用途（作用）:对多巴胺、羟色胺为首的多数神经物质受体都有拮抗作用。

◆苯甲酰胺衍生化合物

（±）-舒必利（±）-Sulpiride

CAS No. 15676-16-1 C15H23N3O4S=341.43 纯度:98.0+％（Titration） 可溶性溶剂:稀醋酸 用途（作用）:苯甲酰胺衍生物。对多巴胺D2受体有阻断作用。

盐酸舒托必利（Sultopride Hydrochloride）

CAS No. 23694-17-9 C17H26N2O4S・HCl=390.93 纯度:90.0 ～ 105.0％（Titration） 可溶性溶剂:水 保存条件: 用途（作用）:苯甲酰胺衍生物。对多巴胺D2受体有阻断作用。

盐酸硫必利（Tiapride Hydrochloride）

CAS No. 51012-33-0 C15H24N2O4S・HCl=364.89 纯度:98.0+％（HPLC） 可溶性溶剂:水 用途（作用）:苯甲酰胺衍生物。对多巴胺D2受体有阻断作用。

尼莫纳地（Nemonapride）

CAS No. 75272-39-8 C21H26ClN3O2=387.91 纯度:99+％ 可溶性溶剂:乙醇、DMSO 用途（作用）:苯甲酰胺衍生物。对多巴胺D2受体有阻断作用。

相关资料详情请查看：http://www.boppard.cn/pdf/show/80.html

烯丙基的羟基化

●　硒氧化

●　比起用二氧化硒，氧化烯丙基的C-H键更容易得到丙烯醇

●　使用TBHP作为循环氧化剂可减少二氧化硒的用量

反应例子^【a】