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一款合成高质量、高产量mRNA的体外转录（IVT）试剂盒
·通过体外转录（IVT）合成带有Cap结构和Poly(A)序列的mRNA；
·优化的T7 RNA聚合酶用于IVT反应，RNA合成效率高、产量大；
·独立包装的NTPs，方便修饰NTPs替换，且不影响mRNA产量；
·采用In-Fusion无缝克隆，轻松构建模板质粒DNA；
·使用氯化锂（LiCl）溶液进行RNA纯化，可立即进行下游应用。
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| ■ 制品说明 |
Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System是能够简便、高效合成带有Cap结构和Poly(A)序列的mRNA的体外转录试剂盒。它包含以下两种制品：
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① Cloning Kit for mRNA Template（Code No. 6143）：
本试剂盒用于将模板DNA无缝克隆到预线性化载体（包含在本试剂盒中）中构建用于体外转录反应的模板质粒。预线性化载体中包含T7 启动子、转录起始序列 (AGG)、5′-UTR（非编码区）、3′-UTR、和105-base Poly(A) 序列。试剂盒还包含用于将目标DNA无缝克隆到预线性化载体的In-Fusion Snap Assembly Master Mix和FLuc对照片段（包括15 bp，3′ In-Fusion sequence；FLuc CDS；和15 bp，5′ In-Fusion sequence）。
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② Takara IVTpro T7 mRNA Synthesis Kit（Code No. 6144）：
本试剂盒以含有 T7 启动子序列的双链 DNA 为模板，使用优化的高效T7 RNA聚合酶，通过体外转录可合成大量mRNA。除此以外，还包含用于IVT反应后消化模板DNA的DNase I和用于纯化mRNA的氯化锂 (LiCl) 溶液。真核细胞翻译蛋白质需要RNA的5’端有Cap结构，本试剂盒配合使用CleanCap Reagent AG（TriLink公司的Cap类似物）可以高效制备具有Cap结构的mRNA。另外，试剂盒包含单独的NTPs，方便优化或使用修饰NTPs如假尿苷替换，而且不会明显降低mRNA的产量。使用本产品，每次反应（20 μl 反应体系）可以合成高达 200μg 或更多的RNA。可以根据需要放大反应体系，即使使用10倍（200μl）反应体系也不影响mRNA预期产量（请参考说明书实验例）。※Cap类似物不包含在本产品中，请另外准备CleanCap Reagent AG (TriLink公司)。
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| 使用Takara IVTpro™ 系统合成 mRNA时，通过In-Fusion方法克隆目标基因（GOI）后，使用不会在 Poly (A) 下游留下额外序列的限制性内切酶切割是非常重要的。强烈建议使用 Hind III（Code No. 1060A/B）对用于mRNA合成的质粒进行线性化（请参考说明书和载体图谱信息）。 |
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| ■ 用途 |
· 用于体外转录（IVT）模板质粒DNA的构建
· 配合使用TriLink公司的CleanCap Reagent AG体外转录合成mRNA
· 使用其它Cap类似物如Anti-Reverse Cap Analog (ARCA)合成带帽结构的mRNA
(* 请注意，使用ARCA时，需要设计与本产品不同的模板序列。)
· 用于长链非编码RNA（Long non-coding RNA）的合成
· 向导RNA（guide RNA）的合成
· siRNA前体的合成
· 用于RT-qPCR的RNA标准模板的合成
· RNA探针的合成
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| ■ 制品内容 |
| Cloning Kit for mRNA Template（Code No. 6143）（10次反应） |
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| 产品组分 |
体积量 |
件数/Kit |
| 1. Linearized Template Vector (50 ng/μl) |
10 μl |
1 |
| 2. FLuc Control Fragment (100 ng/μl) ＊1 |
10 μl |
1 |
| 3. 5X In-Fusion Snap Assembly Master Mix |
20 μl |
1 |
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| *1：由 In-Fusion 序列 (15 bp) + FLuc-CDS + In-Fusion 序列 (15 bp) 组成的对照片段 (1,683 bp) |
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| Takara IVTpro T7 mRNA Synthesis Kit（Code No. 6144）（20次量、20 μl反应体系） |
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| 产品组分 |
体积量 |
件数/Kit |
| 1. 10X Transcription Buffer |
40 μl |
1 |
| 2. 10X ATP |
40 μl |
1 |
| 3. 10X CTP |
40 μl |
1 |
| 4. 10X GTP |
40 μl |
1 |
| 5. 10X UTP |
40 μl |
1 |
| 6. 10X Enzyme Mix |
40 μl |
1 |
| 7. Nuclease-Free Water |
1 ml |
3 |
| 8. DNase I |
80 μl |
1 |
| 9. Lithium Chloride Precipitation Solution |
600 μl |
1 |
| 10. Positive Control Template (FLuc) (0.5 μg/μl)＊2 |
10 μl |
1 |
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| *2：由T7 启动子 + 5’UTR + FLuc-CDS + 3’UTR + Poly (A) 序列组成的线性质粒DNA。 |
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| ■ 实验操作注意事项 |
· 本制品是通过IVT反应合成RNA的试剂。如果双链DNA模板、试剂、试管、微量移液器吸头或反应中使用的其他材料混入RNase污染，会导致使用本试剂盒获得的RNA收量降低或片段化。在反应中使用专用试管和微量移液器吸头，并戴上新的一次性手套以防止RNase污染。
· 10X Enzyme Mix 不要剧烈搅拌。
· 使用前将Lithium Chloride Precipitation Solution在室温下融化。融解后，如果充分混合后仍可见沉淀，可37℃保温溶解。如果仍有沉淀物，请直接使用，对性能没有影响。
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| ■ 保存 |
-20℃
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| ■ 试剂盒以外的其它必要试剂（主要试剂） |
· CleanCap Reagent AG（TriLink公司）
· 修饰NTPs
· 限制酶（Hind III等等） |
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| ■ 序列信息 FLuc Control Fragment |
序列信息（fasta格式）：点此进行下载
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| 该序列与Positive Control Template（FLuc）中2,685～4,367（1,683 bp）的序列相同。 |
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| ■ 序列信息 Linearized Template Vector |
序列信息（fasta格式）：点此进行下载
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| Linearized Template Vector（2,921 bp） |
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NeoR/KanR: 53～847
Ori: 1,172～1,760
CMV enhancer: 1,861～2,240
CMV promoter: 2,241～2,444 |
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T7 promoter sequence: 2,489～2,505
Transcription start sequence (AGG): 2,506～2,508
5’UTR: 2,509～2,559
Upstream In-Fusion region (15 bp): 2,545～2,559 |
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| In-Fusion cloning site (linearized site): between 2,559 and 2,560 |
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Downstream In-Fusion region (15 bp): 2,560～2,574
3’UTR: 2,560～2,672
Poly(A)105: 2,673～2,777
Restriction enzyme sites for plasmid linearization: 2,776～2,801(Hind III, Xho I, Sal I, Avr II, BamH I) |
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Poly(A) Forward Primer: 2,570～2,589
Poly(A) Reverse Primer: 2,863～2,882 |
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| <T7启动子后序列的详细信息> |
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| ■ 载体信息 Positive Control Template（FLuc） |
序列信息（fasta格式）：点此进行下载
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| Positive Control Template（FLuc）（4,574 bp） |
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NeoR/KanR: 193～987
Ori: 1,312～1,900
CMV enhancer: 2,001～2,380
CMV promoter: 2,381～2,584 |
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T7 promoter sequence: 2,629～2,645
Transcription Start Sequence (AGG): 2,646～2,648
5’UTR: 2,649～2,699
FLuc CDS: 2,700～4,352
3’UTR: 4,353～4,465
Poly(A)105: 4,466～4,570 (FLuc Control Fragment-derived sequence: 2,685～4,367)
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Linearized site by Hind III (5′ overhangs) : 4,569 (4,573)
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＜T7启动子后序列的详细信息＞
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