| 基因编辑后高通量SNP筛选 | ||||||
| 品牌 | Code No. | 产品名称 | 包装量 | 价格（元） | 说明书 | 数量 |
| Clontech | 632652 | Guide-it SNP Screening Kit | 100 Rxns | ￥4,863 |  |
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| Clontech | 632653 | Guide-it SNP Screening Kit | 400 Rxns | ￥12,277 | |
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页面更新：2020-03-05 11:04:53
| 基因编辑后基因敲入检测 | ||||||
| 品牌 | Code No. | 产品名称 | 包装量 | 价格（元） | 说明书 | 数量 |
| Clontech | 632659 | Guide-it™ Knockin Screening Kit | 100 Rxns | ￥4,733 |  |
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| Clontech | 632660 | Guide-it™ Knockin Screening Kit | 400 Rxns | ￥11,923 | |
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| 基因编辑后基因敲入检测试剂盒，简便·快速 Guide-it Knockin Screening Kit |
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| Guide-it Knockin Screening Kit可高灵敏度地检测通过同源重组（homologous recombination, HR）所产生的基因编辑位点，可用于检测使用CRISPR/Cas9等技术进行基因编辑的批量或者单克隆细胞。该试剂盒采用了简单的基于荧光的检测方法，不论所敲入的插入物长度（从单碱基替换到更长的插入片段）或被编辑的基因组区域序列如何，都可以对由同源重组（HR）所产生的基因组编辑位点进行检测，这种检测方法简便可靠。 |
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| 该试剂盒操作流程简便快速，主要包括基因组靶标位点PCR扩增，绿色和红色双色荧光检测的酶法测定。这个酶法测定实验，使用荧光读板机或定量PCR仪检测荧光信号即可进行测定，不需要其他特殊仪器。整个操作流程大约需要4个小时，由于荧光信号的检测与基因组靶标位点上目标序列的正确引入是正相关的关系，从而确保可以检测到突变。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 在引入单核苷酸多态性（SNP）的应用中，该检测方法能够在混合和克隆细胞群中高灵敏度地检测出单核苷酸替换，可鉴定识别含有两个不同等位基因的杂合克隆（例如携带经编辑（SNP）和未经编辑（WT）各一个拷贝的等位基因）。对于敲入更长基因序列的应用，使用这种检测方法可以在插入序列的5'和3'末端，同时检测是否无缝插入。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ■ 特点 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| · 无需测序，快速确定是否发生了正确的基因敲入 · 可用于批量或者单克隆细胞检测 · 操作简单快速，4小时可完成检测 · 无需特殊仪器，使用荧光读板机或者定量PCR仪进行测定 · SNP分析理想选择，双色检测可同时检测两个不同等位基因（SNP和WT等） |
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| ■ 应用 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| · 在经过编辑的细胞群中快速检测单核苷酸替换或准确敲入 · 在杂合克隆中同时检测已编辑和未编辑的等位基因 · 在进行单细胞克隆之前对杂合的细胞群进行编辑效率分析 |
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| ■ 在线工具 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 寡核苷酸DNA设计对于使用Guide-it Knockin Screening Kit进行SNP分析是非常必要的，这个在线工具可以让您轻松设计每个寡核苷酸DNA。 |
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| 注意：此在线工具仅用于设计检测单碱基替换的寡核苷酸DNA，而不能用于检测长片段插入的寡核苷酸DNA的设计。 |
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| Oligo design tool for Guide-it SNP screening assays |
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| ■ Tech Note | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 在iPSC中引入与疾病相关的遗传变异，包括SNP，可以评估这些变异在相关细胞类型中的表型效应，并消除由于遗传背景引起的变异性，从而可以更精细地分析疾病机制并更快速地评估潜在疗法 （例如，药物筛选）。Guide-it Knockin Screening Kit提供了一种简便快速的方法，可以在繁琐耗时的单细胞克隆分离之前，从大量编辑后的细胞群和最终产生的克隆细胞群中，明确鉴定出成功的同源重组修复(homology-directed repair, HDR)。 |
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| 详情点击图片查看 |
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| ■ 使用实例 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| 图1. 使用Guide-it Knockin Screening Kit检测敲入的插入片段全长 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 基因编辑后，通过FACS或有限稀释法分离的大量细胞群和克隆细胞系可能表现出多种模式，例如野生型（WT），引入插入/缺失（indel）或敲入了全长插入片段。从克隆细胞中提取DNA并扩增靶标位点，然后将PCR产物与两套不同的displacement oligo（紫色）和flap probe进行杂交：一个与插入片段的5'端杂交（Flap-probe oligo A; 绿色），另外一个与3'端杂交（Flap-probe oligo B; 橙色）。如果同源重组成功并且全长插入片段无缝正确插入的情况下，探针会与两端完全杂交，Guide-it Flapase剪切flap probes后产生绿色和红色荧光信号。当仅检测到一种荧光信号（红色或绿色）时，表明插入片段分别在5'端或3'端发生了缺失。如果没有检测到荧光，则表明靶标位点依然是野生型序列或者引入了indel。 |
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| 图2. 引入单碱基替换的常见结果 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 展示了使用基因编辑技术进行单碱基替换（G＞T）的示例，此工作流程示例为G>A替换检测示例。 |
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| Panel A. 在基因组靶标位点的结果：当在靶标位点没有发生成功切割，或者成功切割后发生了基于非同源末端连接(NHEJ)的准确修复的情况下，靶标位点没有发生变化，结果仍然为野生型(WT)序列。当切割后发生了基于NHEJ的不准确修复的情况下，其结果是在靶标位点引入了插入或缺失（Indel），这可能会导致基因敲除（KO；极有可能的结果）。当切割后发生了准确的HDR时，则会在靶标位点引入SNP。 Panel B. 二倍体细胞中等位基因组合结果：在二倍体细胞中进行编辑时，每个等位基因的编辑结果可能会有所不同，从而产生多种可能的组合。如果没有发生基因编辑，细胞仍然可以保持纯合型（野生型；顶部）；如果发生了不准确的NHEJ修复，会有一个或两个等位基因被修饰（Indel；中间）；如果发生了成功的HDR，则可以获得一个或两个等位基因中引入了目标SNP的细胞（成功的HDR；底部）。 |
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| 图3. 使用Guide-it Knockin Screening Kit进行SNP分析的流程 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 此示例工作流程演示了对G>A单碱基替换的分析，其中G是野生型碱基，被编辑为A。在基因编辑后，将单细胞扩培成为克隆细胞系，目标基因的靶标位点可能具有几种不同的基因型结果。扩增靶位点后，将PCR产物与不同的寡核苷酸探针进行杂交：displacement oligo（紫色）与flap-probe oligo A（绿色；编码SNP等位基因，A）或flap-probe oligo B（橙色；编码WT等位基因，G）组合使用。寡核苷酸退火至PCR产物后，Guide-it Flapase酶（剪刀所示）识别完全的碱基配对，并切割flap-probe oligo 5’端部分（绿色或橙色阴影）。切割下来的flaps由相对应的Guide-it flap detectors检测，并分别产生绿色或红色荧光信号。在上面的示例中，在靶标位点仅产生红色信号的克隆细胞系分析是纯合WT（G/G），而同时产生红色和绿色信号的则是携带已编辑和WT等位基因（G/A）的杂合克隆。 |
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| 图4. 检测iPS细胞群中PSEN1位点的准确碱基替换 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 为了验证Guide-it Knockin Screening Kit的SNP检测功能，使用CRISPR/Cas9系统构建了编码PSEN1基因突变体A>G替换（M164V）的杂合型iPS细胞系，该突变体与早发型阿尔茨海默氏病相关。 |
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| Panel A. 使用包含PAM沉默突变的HDR模板，在PSEN1基因座上进行准确基因编辑：如果同源重组成功，编辑后的PSEN1基因座将编码邻近PAM序列发生沉默突变（红色，小写）的SNP（蓝色，小写）或者WT（紫色，小写）等位基因。 Panel B. 基因组编辑后在批量iPS细胞群中成功检测碱基替换：使用正义或者反义HDR模板进行基因编辑，然后使用Guide-it Knockin Screening Kit检测是否在每种情况下都成功发生了基因编辑。 设计displacement和flap-probe oligos，用于检测由相应HDR模板编码的邻近PAM序列发生沉默突变（G>C）的WT或者SNP等位基因，将分别产生红色和绿色荧光信号。在独立平行实验中，将Cas9蛋白质（阴性对照），Cas9-sgRNA RNP复合物（KO）或者RNP复合物和正义或者反义WT/SNP HDR模板混合物通过电穿孔的方式分别导入至细胞中。合成检测PAM序列沉默突变的WT或SNP编码序列的寡核苷酸探针，进行平行检测并作为阳性对照。对于每个电穿孔混合物中包含HDR模板的编辑实验组，可以在批量细胞群中检测到成功的HDR。阴性对照组没有显示绿色和红色荧光信号，这证实了flap-probe oligos的特异性，因为在未编辑的WT序列存在下它们没有产生假阳性荧光信号。 |
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| ■ 产品组份 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| ■ 保存 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| MightyPrep Reagent for DNA：4℃ |
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| 其它：－20℃ |
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产品详情请点击： |
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页面更新：2020-03-05 11:13:01
上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。
使用 LunaScript 反转录预混液试剂盒（无引物）将 1 μg Jurkat 总 RNA 反转录成 cDNA，引物为 d（T））23VN，使用标准反应条件 55℃ 孵育 10 分钟，95℃ 孵育 1 分钟。之后使用不同 PCR 扩增试剂对 cDNA 产物进行检测。对于 5 kb以内的常规应用，建议使用 OneTaq 2X 预混液（NEB #M0482）；对于高保真扩增，建议使用 Q5 热启动超保真 2X 预混液（NEB #M0494）；对于长片段高产量扩增，建议使用 LongAmp Taq 2X 预混液（NEB #M0287）（数据未显示）
上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。
无需纯化，直接从细胞到 RNA 定量
• 试剂盒包含 100 次裂解反应和 500 次染料一步法 RT-qPCR 反应
• 有效裂解多种细胞系的 10 至 10 万个细胞
• 仅需 15 分钟即可完成细胞裂解、RNA 释放和基因组 DNA 去除
• 联合使用 LunaWarmStart® RT 和 Hot Start Taq，提高了热稳定性，且可在室温下建立反应体系
• 可单独购买裂解模块：Luna Cell Ready 裂解模块（NEB＃E3032）
Luna Cell Ready 染料一步法 RT-qPCR 试剂盒为直接染料法 RNA 检测和定量提供了所有必要的组分，且无需进行 RNA 提取和纯化。Luna Cell Ready 染料一步法 RT-qPCR 试剂盒包括：1）Luna Cell Ready 裂解模块（NEB＃E3032S）和 2）Luna 通用一步法 RT-qPCR Kit（NEB＃E3005L）。
细胞培养常用于替代活体生物来分析基因表达或对治疗的反应。传统上使用柱提法或化学试剂法从处理过的细胞中提取和纯化 RNA。
Luna Cell Ready 裂解模块整合了 DNase I 和 Luna Cell Ready 蛋白酶的功能，仅需 15 分钟即可完成细胞裂解、RNA 释放和基因组 DNA 去除。裂解模块包含独特的 Luna Cell Ready RNA 保护试剂，可在细胞裂解过程中保持 RNA 完整性。50 µl 裂解体系下可对 10-10 万个细胞进行裂解反应。2 µl 裂解产物 （相当于 0.2–4000 个细胞的 RNA） 即可实现 20 µl 体系的 RT-qPCR 反应。与其它 Luna 产品一样，裂解缓冲液包含惰性蓝色示踪染料，使整个加样流程可视化。
Luna 通用一步法 RT-qPCR 试剂盒可兼容大多数实时荧光定量仪器的 SYBR/FAM 荧光通道，进行目标 RNA 的实时定量分析。在该试剂盒中，联合使用热启动 Taq DNA 聚合酶与新型 Luna WarmStart 反转录酶，通过适配体可逆抑制来双重控制酶活性。Luna 通用一步法 RT-qPCR 试剂盒可以直接将 Luna Cell Ready 裂解模块制备的细胞裂解物中的 RNA 转录本进行检测和定量。
下表列出的细胞系可使用 Luna Cell Ready 裂解模块裂解。这些细胞进行 5 log 梯度稀释（100000-10 细胞/50 µl 裂解反应），并取 1 ul 裂解产物进行 20 µl 体系的一步法 RT-qPCR 反应。每个细胞系的线性结果区域显示在最后一列。此外，经测试一些昆虫细胞系也能用上述裂解液裂解。
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细胞系 |
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|
特性 |
菌种 |
50 ml 裂解体系中的细胞数量 |
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A549 |
Adherent |
H. sapiens, Lung, carcinoma |
10 – 100,000 |
|
HEK293 |
Adherent |
H. sapiens, Kidney |
10 – 100,000 |
|
HeLa |
Adherent |
H. sapiens, Cervix, adenocarcinoma |
10 – 100,000 |
|
HepG2 |
Adherent |
H. sapiens, Liver, carcinoma |
10 – 100,000 |
|
NCI-H460 |
Adherent |
H. sapiens, Lung, carcinoma |
10 – 100,000 |
|
SK-N-SH |
Adherent |
H. sapiens, Brain, Neuroblastoma |
10 – 100,000 |
|
U2Os |
Adherent |
H. sapiens, Bone, osteosarcoma |
10 – 10,000 |
|
Jurkat |
Suspension |
H. sapiens, T lymphocyte, leukemia |
10 – 100,000 |
|
K-562 |
Suspension |
H. sapiens, Lymphoblast, leukemia |
10 – 1,000 |
图一：Luna Cell Ready 一步法 RT-qPCR 实验流程
Luna Cell Ready 一步法 RT-qPCR 试剂盒提供了直接从细胞（50 µl 体系可裂解高达 10 万个细胞）到 RNA 检测和定量的所有组分。Luna Cell Ready 裂解模块整合了 DNase I 和 Luna Cell Ready 蛋白酶的功能，仅需 15 分钟即可完成细胞裂解、RNA 释放和基因组 DNA 去除。2 µl 裂解产物（相当于 0.2–4000 个细胞中的 RNA）即可实现 20 µl 体系的 RT-qPCR 反应。
图二：Luna Cell Ready 染料一步法 RT-qPCR 试剂盒可直接对 5-log 梯度稀释细胞的裂解物进行灵敏精准的 RNA 定量
梯度稀释的 A549 细胞（100,000-10）使用标准反应条件（37°C 裂解 10 分钟，25°C 灭活 5 分钟），在 50 µl 的 Luna Cell Ready 裂解体系（NEB＃E3032）中裂解。使用 Luna 通用一步法 RT-qPCR 试剂盒（NEB＃E3005）加入 1 μl 细胞裂解物（相当于 20 μl RT-qPCR 反应体系中 0.2-2,000 个细胞）对目的基因（GOI）进行定量，每个浓度的样品都做了重复。结果展示了两个高频靶标（A）：β-actin 和一个低频靶标（B）：SMG1。右图展示了扩增效率（E）和线性关系（R2）。
图三：Luna Cell Ready 染料一步法 RT-qPCR 试剂盒与提纯 RNA 均可对 5-logs 细胞梯度样品进行精准可信的 RNA 定量
梯度稀释的 A549 细胞（100,000-10）使用标准反应条件（37°C 裂解 10 分钟，25°C 灭活 5 分钟），在 50 µl 的 Luna Cell Ready 裂解体系（NEB＃E3032）中裂解，也可使用柱提法提纯 RNA。A.使用 Luna 通用一步法 RT-qPCR 试剂盒（NEB＃E3005）对目的基因（GOI）进行定量，加入 1 μl 细胞裂解物（实心圆）或纯化的 RNA（空心圆）（相当于 20 µl RT-qPCR 反应中有 0.2-2,000 个细胞），每个浓度的样品都做了重复。左图：在 5-logs 细胞梯度中检测高频靶标 β-actin和两个低频靶标 ARF3 和 Tubulin。每个靶标的扩增效率在图中左下方显示。B.在 A 图中 5-log 细胞梯度稀释样品的目标基因相对于 β-actin 的 Cq 值（ΔCq（GOI）），平均 Cqs 通过横线指示。
图四：Luna Cell Ready 染料一步法 RT-qPCR 试剂盒的扩增效率及灵敏度均优于其它市售的细胞裂解一步法 RT-qPCR 试剂盒。
梯度稀释的 A549 细胞（100,000-10）使用标准反应条件，在 50 µl 的 Luna Cell Ready 裂解体系（NEB＃E3032）中裂解。相同的样品使用 Bio-Rad（SingleShot SYBR Green One-Step Kit, #172-5095）、Qiagen（SingleShot SYBR Green One-Step Kit, #172-5095）和 Thermo Fisher（Cells-to-CT 1-Step PowerSYBR Green Kit, A25600）并分别按照厂家说明书进行裂解。然后使用每个试剂盒中的一步法 RT-qPCR 模块，加入 1 μl 细胞裂解物（相当于 20 μl RT-qPCR 反应体系中 0.2-2,000 个细胞），对目的基因进行定量，每个浓度的样品都做了重复。对于所有试剂盒，5-log 梯度稀释细胞均显示了 β-actin,（高频靶标）和 RPL32、Tubulin （低频靶标）的扩增。为了使结果标准化，将总荧光的 12％ 设置为阈值。图中显示了扩增效率（E）及最高与最低的 Cq 值。
图五：对 24 个靶标测试显示，Luna Cell Ready 染料一步法 RT-qPCR 试剂盒与其它市售的细胞裂解一步法 RT-qPCR 试剂盒相比，灵敏度最高。
2500 个 A549 细胞，使用标准反应条件，在 50 µl 的 Luna Cell Ready 裂解体系（NEB＃E3032）中裂解。或使用市售的 Bio-Rad（SingleShot SYBR Green One-Step Kit, #172-5095）、Qiagen（SingleShot SYBR Green One-Step Kit, #172-5095）和 Thermo Fisher（Cells-to-CT 1-Step PowerSYBR Green Kit, A25600）并分别按照厂家说明书进行裂解。每个试剂盒做两个生物重复。然后使用来自每个试剂盒的一步法 RT-qPCR 模块，加入 1 μl 细胞裂解物（相当于 20 µl RT-qPCR 反应中 50 个细胞），对 24 个目标基因进行定量，每个生物样品均做重复。结果显示了 NEB （实心橙色圆圈），BioRad（空心正方形），Qiagen（空心三角形）和 Thermo Fisher（十字形）的平均 Cqs。为了使结果标准化，将总荧光的 12％ 设置为阈值。Luna Cell Ready 染料一步法 RT-qPCR 试剂盒显示了不同表达水平下 23/24 的基因 Cq 值最早，平均比 Bio-Rad 快2.3 Cq，比 Qiagen 快 3.8 Cq，比 Thermo Fisher 快 3.6 Cq。
随该产品提供的试剂
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储存（°C） |
|
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浓度 |
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|
Luna Cell Ready Lysis Buffer |
-20 |
2 X |
|
Luna Cell Ready RNA Protection Reagent |
-20 |
25 X |
|
Luna Cell Ready Protease |
-20 |
25 X |
|
Luna Cell Ready Stop Solution |
-20 |
10 X |
|
DNase I （RNase-free） |
-20 |
10 X |
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Luna® WarmStart® RT Enzyme Mix |
-20 |
20 X |
|
Luna® Universal One-Step Reaction Mix |
-20 |
2 X |
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Nuclease-free Water |
-20 |
实验需要但不提供的试剂耗材
• 磷酸盐缓冲液（PBS）
• 目标特异性引物
• 细胞
• Eppendorf 管，PCR 联管
• PCR 板
• qPCR 仪器
• 移液器和枪头（为减少交叉污染，应使用带滤芯的枪头）
储存温度
-20℃
上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。
无需纯化，直接从细胞到 RNA 定量
• 试剂盒包含 100 次裂解反应和 500 次探针一步法 RT-qPCR 反应
• 有效裂解多种细胞系的 10 至 10 万个细胞
• 仅需 15 分钟即可完成细胞裂解、RNA 释放和基因组 DNA 去除
• 配合使用 LunaWarmStart® RT 和 Hot Start Taq，提高了热稳定性且可在室温下建立反应体系
• 可单独购买裂解模块：Luna Cell Ready 裂解模块（NEB＃E3032）
Luna Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒为直接探针法 RNA 检测和定量提供了所有必要的组分，且无需进行 RNA 提取和纯化。Luna Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒包含两个模块：1）Luna Cell Ready 裂解模块（NEB＃E3032S）和 2）Luna 通用探针一步法 RT-qPCR Kit（NEB＃E3006L）。
细胞培养常用于替代活体生物来分析基因表达或对治疗的反应。传统上使用柱提法或化学试剂法从处理过的细胞中提取和纯化 RNA。
Luna Cell Ready 裂解模块整合了 DNase I 和 Luna Cell Ready 蛋白酶的功能，仅需 15 分钟即可完成细胞裂解、RNA 释放和基因组 DNA 去除。裂解模块包含独特的 Luna Cell Ready RNA 保护试剂，可在细胞裂解过程中保持 RNA 完整性。50 µl 裂解体系下可对 10-10 万个细胞进行裂解反应。2 µl 裂解产物 （相当于 0.2–4000 个细胞的 RNA） 即可实现 20 µl 体系的 RT-qPCR 反应。与其它 Luna 产品一样，裂解缓冲液包含惰性蓝色示踪染料，使整个加样流程可视化。
Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒可兼容大多数实时荧光定量仪器的各个通道，进行目标 RNA 的实时定量分析。在该试剂盒中，联合使用热启动 Taq DNA 聚合酶与新型 Luna WarmStart 反转录酶，通过适配体可逆抑制来双重控制酶活性。Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒可以直接将 Luna Cell Ready 裂解模块制备的细胞裂解物中的 RNA 转录本进行检测和定量（单重或多重）。
下表列出的细胞系可使用 Luna Cell Ready 裂解模块裂解。这些细胞进行 5 log 梯度稀释（100000-10 细胞/50 µl 裂解反应），并取 1 ul 裂解产物进行 20 µl 体系的一步法 RT-qPCR 反应。每个细胞系的线性结果区域显示在最后一列。此外，经测试一些昆虫细胞系也能用上述裂解液裂解。
表一：经验证过的细胞系
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细胞系 |
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特性 |
菌种 |
50 ml 裂解体系中的细胞数量 |
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A549 |
Adherent |
H. sapiens, Lung, carcinoma |
10 – 100,000 |
|
HEK293 |
Adherent |
H. sapiens, Kidney |
10 – 100,000 |
|
HeLa |
Adherent |
H. sapiens, Cervix, adenocarcinoma |
10 – 100,000 |
|
HepG2 |
Adherent |
H. sapiens, Liver, carcinoma |
10 – 100,000 |
|
NCI-H460 |
Adherent |
H. sapiens, Lung, carcinoma |
10 – 100,000 |
|
SK-N-SH |
Adherent |
H. sapiens, Brain, Neuroblastoma |
10 – 100,000 |
|
U2Os |
Adherent |
H. sapiens, Bone, osteosarcoma |
10 – 10,000 |
|
Jurkat |
Suspension |
H. sapiens, T lymphocyte, leukemia |
10 – 100,000 |
|
K-562 |
Suspension |
H. sapiens, Lymphoblast, leukemia |
10 – 1,000 |
Luna Cell Ready 一步法 RT-qPCR 试剂盒提供了直接从细胞（50 µl 体系可裂解高达 10 万个细胞）到 RNA 检测和定量的所有组分。Luna Cell Ready 裂解模块整合了 DNase I 和 Luna Cell Ready 蛋白酶的功能，仅需 15 分钟即可完成细胞裂解、RNA 释放和基因组 DNA 去除。2 µl 裂解产物（相当于 0.2–4000 个细胞中的 RNA）即可实现 20 µl 体系的 RT-qPCR 反应。
图二：Luna Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒可直接对 5-log 梯度稀释细胞的裂解物进行灵敏精准的 RNA 定量
梯度稀释的 A549 细胞（100,000-10）使用标准反应条件（37°C 裂解 10 分钟，25°C 灭活 5 分钟），在 50 µl 的 Luna Cell Ready 裂解体系（NEB＃E3032）中裂解。使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒（NEB＃E3006），加入 1 μl 细胞裂解物（相当于 20 μl RT-qPCR 反应体系中 0.2-2,000 个细胞）对目的基因进行定量，每个浓度的样品都做了重复。结果展示了两个高频靶标：β-actin（Texas Red）和 GAPDH（FAM），一个低频靶标：RPL32（HEX），的多重结果（A）和单重结果（B），以及相应的扩增效率（E）和线性关系（R2）。（C）所有三个目标的多重和单重的 Cq 叠加证明了这些结果的一致性。
三：Luna Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒与提纯 RNA 均可对 5-logs 细胞梯度样品进行精准可信的 RNA 定量
梯度稀释的 A549 细胞（100,000-10）使用标准反应条件（37°C 裂解 10 分钟，25°C 灭活 5 分钟），在 50 µl 的 Luna Cell Ready 裂解体系（NEB＃E3032）中裂解，也可使用柱提法提纯 RNA。A.使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒（NEB＃E3006）对目的基因进行定量，加入 1 μl 细胞裂解物（实心圆，左）或纯化的 RNA（空心圆，右）（上样量相当于 20 µl RT-qPCR 反应中有 0.2-2,000 个细胞），每个浓度的样品都做了重复。在 5-logs 细胞梯度中检测高频靶标 β-actin 和两个低频靶标 ARF3 和 Tubulin。每个靶标的扩增效率在图中左下方显示。
图四：Luna Cell Ready 染料一步法 RT-qPCR 试剂盒的扩增效率及灵敏度均优于其它市售的细胞裂解一步法 RT-qPCR 试剂盒。
梯度稀释的 A549 细胞（100,000-10）使用标准反应条件，在 50 µl 的 Luna Cell Ready 裂解体系（NEB＃E3032）中裂解。相同的样品使用 Bio-Rad（SingleShot™ Probes One-Step Kit for Cell Lysis and RT-qPCR, #172-5070）、Qiagen（FastLane Cell Probe Kit, #216413）和 Thermo Fisher（Cells-to-CT 1-Step TaqMan Kit, A25603）并分别按照厂家说明书进行裂解。然后使用每个试剂盒中的一步法 RT-qPCR 模块，加入 1 μl 细胞裂解物（相当于 20 μl RT-qPCR 反应体系中 0.2-2,000 个细胞），对目的基因进行定量，每个浓度的样品都做了重复。5-log 梯度稀释的细胞通过多重实验测试了 β-actin （Tye）、GAPDH （FAM）和 RPL32 （Cy5）的扩增。为了使结果标准化，将每个试剂盒总荧光值的 10％（Tye）、5％（FAM）、15％（Cy5）设置为阈值。图中显示了扩增效率（E）及最高与最低的 Cq 值。
随该产品提供的试剂
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储存（°C） |
浓度 |
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|
Luna Cell Ready Lysis Buffer |
-20 |
2 X |
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Luna Cell Ready RNA Protection Reagent |
-20 |
25 X |
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Luna Cell Ready Protease |
-20 |
25 X |
|
Luna Cell Ready Stop Solution |
-20 |
10 X |
|
DNase I （RNase-free） |
-20 |
10 X |
|
Luna® WarmStart® RT Enzyme Mix |
-20 |
20 X |
|
Luna® Universal Probe One-Step Reaction Mix |
-20 |
2 X |
|
Nuclease-free Water |
-20 |
• 磷酸盐缓冲液（PBS）
• 目标特异性引物
• 细胞
• Eppendorf 管
• PCR联管
• PCR 板
• qPCR 仪器
• 移液器和枪头（为减少交叉污染，应使用带滤芯的枪头）
-20℃
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细胞培养常用于替代活体生物来分析基因表达或对治疗的反应。传统上使用柱提法或化学试剂法从处理过的细胞中提取和纯化 RNA.Luna Cell Ready 裂解模块无需进行传统的 RNA 提取步骤即可评估RNA表达水平，是一种快速、方便且灵敏的替代方案。该模块可同时进行细胞裂解、RNA 释放、基因组 DNA 去除，获得的细胞裂解物可直接使用Luna通用一步法 RT-qPCR 试剂盒进行 RT-qPCR 分析。与其它 Luna 产品一样，裂解缓冲液包含惰性蓝色示踪染料，使整个加样流程可视化。
|
细胞系 |
特性 |
菌种 |
50 ml 裂解体系中的细胞数量 |
|
A549 |
Adherent |
H. sapiens, Lung, carcinoma |
10 – 100,000 |
|
HEK293 |
Adherent |
H. sapiens, Kidney |
10 – 100,000 |
|
HeLa |
Adherent |
H. sapiens, Cervix, adenocarcinoma |
10 – 100,000 |
|
HepG2 |
Adherent |
H. sapiens, Liver, carcinoma |
10 – 100,000 |
|
NCI-H460 |
Adherent |
H. sapiens, Lung, carcinoma |
10 – 100,000 |
|
SK-N-SH |
Adherent |
H. sapiens, Brain, Neuroblastoma |
10 – 100,000 |
|
U2Os |
Adherent |
H. sapiens, Bone, osteosarcoma |
10 – 10,000 |
|
Jurkat |
Suspension |
H. sapiens, T lymphocyte, leukemia |
10 – 100,000 |
|
K-562 |
Suspension |
H. sapiens, Lymphoblast, leukemia |
10 – 1,000 |
图一：Luna Cell Ready 一步法 RT-qPCR 实验流程
Luna Cell Ready 裂解模块整合了 DNase I 和 Luna Cell Ready 蛋白酶的功能，可简单高效的进行细胞裂解，仅需 15 分钟即可完成细胞裂解、RNA 释放和基因组 DNA 去除。2 µl 裂解产物（相当于 0.2–4000 个细胞中的 RNA）即可实现 20 µl 体系的 RT-qPCR 反应。
试剂盒组分
随该产品提供的试剂
|
储存（°C） |
浓度 |
|
|
Luna Cell Ready Lysis Buffer |
-20 |
2 X |
|
Luna Cell Ready RNA Protection Reagent |
-20 |
25 X |
|
Luna Cell Ready Protease |
-20 |
25 X |
|
Luna Cell Ready Stop Solution |
-20 |
10 X |
|
DNase I （RNase-free） |
-20 |
10 X |
储存温度
-20℃
WHATMAN GF/A玻纤滤纸1820-090
无粘结剂，细小颗粒截留度好、流速快、负载力高，应用于药品测定之前药粉溶解液的精密过滤，或用于检测废水污染、空气污染、藻类和细菌培养、食品分析、蛋白过滤和ß-放射性免疫测定，以及放射性碘、汽车尾气烟气收集，环境空气PM2.5质量浓度、多环芳香烃（PAHs）、苯并芘（BaP）、多氯联苯（PCB）等的测定。还作为电池隔膜用于锂离子电池中，或电池材料的质量控制过程（如电极电位测定），GF/A提供一次性过滤漏斗。
此类滤纸也以滤杯和一次性过滤漏斗形式提供。
WHATMAN GF/A玻纤滤纸1820-090技术参数：
| 等级： | Grade GF/A1) |
| 液体中的颗粒保留： | 1.6μm |
| 过滤速度： | 快速 |
| 气体流速： | 4.3 s/100ml/in2 |
| 常规厚度： | 260μm |
| 基本重量： | 53g/m2 |
| 材质： | 硼硅酸玻璃 |
| 属性特点： | 高负载能力 |
| 黏合剂类型： | 无黏合剂 |
订购信息：
| 1820-021 | GF/A 2.1CM 100/PK |
| 1820-024 | GF/A 2.4CM 100/PK |
| 1820-025 | GF/A 2.5CM 100/PK |
| 1820-037 | GF/A 3.7CM 100/PK |
| 1820-042 | GF/A 4.25CM 100/PK |
| 1820-047 | GF/A 4.7CM 100/PK |
| 1820-050 | GF/A 5.0CM 100/PK |
| 1820-055 | GF/A 5.5CM 100/PK |
| 1820-060 | GF/A 6.0CM 100/PK |
| 1820-061 | GF/A 6.0CM RIM 50/PK |
| 1820-070 | GF/A 7.0CM 100/PK |
| 1820-090 | GF/A 9.0CM 100/PK |
| 1820-110 | GF/A 11.0CM 100/PK |
| 1820-125 | GF/A 12.5CM 100/PK |
| 1820-150 | GF/A 15CM 100/PK |
| 1820-240 | GF/A 24CM 100/PK |
| 1820-6537 | GF/A 8.1CM 100/PK |
| 1820-8013 | GF/A F.B.T. 1.3CM 100/PK |
| 1820-866 | GF/A 8x10IN 100/PK |
| 1820-915 | GF/A 46x57CM 25/PK |
| 1820-9741 | GF/A 100X170MM 25/PK |
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Taq DNA 聚合酶是一种耐热聚合酶，具有 5´ →3´ 聚合酶活性和 5´ 结构特异性核酸内切酶活性。该酶是 PCR 中应用最广泛的酶。为了便于各种 PCR 反应，Taq DNA 聚合酶配套有不同的反应缓冲液。标准 Taq缓冲液专门针对已有的 PCR 平台所设计，它是 DHPLC 和高通量实验的理想选择。NEB 设计的 ThermoPol 缓冲液能够提高反应产量，即使是在苛刻的条件下也表现不凡。更为方便的是，Taq DNA 聚合酶还有试剂盒以及预混液两种剂型可供选择。此外还提供了 Quick-Load Taq 2X 预混液剂型，可用于直接凝胶上样。
超高的性价比、有吸引力的商业条款，NEB 的热启动 Taq 是分子诊断和其它应用的理想选择。与化学修饰或基于抗体结合的热启动聚合酶不同，NEB 的热启动 Taq 利用一种基于核酸适配体（aptamer）技术。这种独特的核酸适配体通过非共价键作用与聚合酶结合，从而抑制聚合酶在非许可温度下的聚合反应。这种新方法不需要激活步骤，减少样品降解的可能性、缩短整个反应时间。
5,000 units/ml。
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LongAmp Taq DNA 聚合酶是 Taq 和 Deep Vent DNA 聚合酶的优化混合，相比单用 Taq DNA 聚合酶，它能以更高的保真度扩增出更长的 PCR 产物。
LongAmp 热启动 Taq DNA 聚合酶利用了一种特定合成的核酸适配体，它能够与酶可逆结合，当温度低于 45℃时抑制聚合酶活性，正常的热循环条件下释放聚合酶。
为了加样方便，LongAmp Taq 与 Long Amp 热启动 Taq DNA 聚合酶均有预混液剂型可供选择。LongAmp Taq PCR 试剂盒包含 LongAmp Taq DNA 聚合酶（2,500 units/ml）、dNTP 混合液（10 mM）、LongAmp Taq 反应缓冲液套装（5X）、MgSO4（100 mM）和无核酸酶污染的水。
2,500 units/ml。
有关该产品特性和应用的参考文献请登陆 www.neb-china.com，www.neb.com。
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– 10X M-MuLV 酶混合液
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– 10X M-MuLV 酶混合液
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ProtoScript II cDNA 第一链合成试剂盒
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ProtoScript II cDNA 第一链合成试剂盒
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**Oligo d(T)23 VN 和随机引物混合液包含 1 mM dNTP
如需稳定扩增不同种类的 DNA 模板，推荐使用 OneTaq® DNA 聚合酶或 Q5® 超保真 DNA 聚合酶。
WHATMAN硝酸纤维素滤膜7184-002孔径0.45um直径25mm
推荐用于大多数日常应用，是在严格控制室内清洁条件下生产的。Whatman膜可以保证非常窄的孔径分布非常低的杂质，这些都可以让zui终用户受益。
更高的强度和韧性
大多数膜本质上都很脆而且不容易操作，但是很少在装载到过滤器或在使用过程中损坏。Whatman硝酸纤维素膜韧性得到明显增强，能承受住在不破坏膜完整性的条件下操作、装载和消毒时的撕裂。在同类产品中经测试已经是zui强韧的膜。
低可提取物水平
滤膜中可提取物水平和过滤或吸附技术的改进一样变得越来越重要。尤其是在药学、免疫学、生物学组织培养和衡量分析应用方面，高的提取物水平会起到负面影响。Whatman硝酸纤维素膜的提取物水平一般比其他同种型号都低。
精控的孔径分布
Whatman滤膜的一个重要特征就是孔径精确度很高。膜的孔径率径先进的生产和控制系统严格控制。另外批间差小，可以保持实验结果的*性。
增加的温度稳定性
滤膜可以在不失完整的情况下在121摄氏度下进行正常消毒。硝酸纤维素膜有圆片、方片和卷等不同规格。
收缩量减少
过多的收缩在消毒过程中会产生问题，也经常会在消毒后在滤器中发生破裂，也可能导致流速的降低和整个过滤量的减少。Whatman滤膜在消毒过程中收缩量很低。
特征和优点
·孔径分布精确能改进表面捕获和分析
·提取物水平低，保证样品的完整性。
WHATMAN硝酸纤维素滤膜7184-002孔径0.45um直径25mm应用
·样品分离
·微生物研究
·水溶液过滤
订购信息：
| 7181-002 | WCN WH 25MM 0.1uM 100/PK |
| 7181-004 | WCN WH 47MM 0.1uM 100/PK |
| 7182-001 | WCN WH 13MM 0.2uM 100/PK |
| 7182-002 | WCN WH 25MM 0.2uM 100/PK |
| 7182-004 | WCN WH 47MM 0.2uM 100/PK |
| 7182-009 | WCN WH 90MM 0.2uM 25/PK |
| 7182-014 | WCN WH 142MM 0.2uM 25/PK |
| 7184-001 | WCN WH 13MM 0.45uM 100/PK |
| 7184-002 | WCN WH 25mm 0.45uM 100/PK |
| 7184-004 | WCN WH 47MM 0.45uM 100/PK |
| 7184-005 | WCN WH 50MM 0.45uM 100/PK |
| 7184-009 | WCN WH 90MM 0.45uM 25/PK |
| 7184-014 | WCN WH 142MM 0.45uM 25/PK |
| 7186-004 | WCN WH 47MM 0.65uM 100/PK |
| 7188-003 | WCN WH 37MM 0.8uM 100/PK |
| 7188-004 | WCN WH 47MM 0.8uM 100/PK |
| 7188-009 | WCN WH 90MM 0.8uM 25/PK |
| 7190-002 | WCN WH 25MM 1.0uM 100/PK |
| 7190-004 | WCN WH 47MM 1.0uM 100/PK |
| 7191-005 | WCN WH 50MM 1.2uM 100/PK |
| 7191-014 | WCN WH 142MM 1.2uM 25/PK |
| 7193-002 | WCN WH 25MM 3.0uM 100/PK |
| 7193-004 | WCN WH 47MM 3.0uM 100/PK |
| 7195-002 | WCN WH 25MM 5.0uM 100/PK |
| 7195-004 | WCN WH 47MM 5.0uM 100/PK |
| 7195-009 | WCN WH 90MM 5.0uM 25/PK |
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– 对照模板和扩增引物
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LyoPrime Luna™ 探针一步法 RT-qPCR 预混冻干粉（含 UDG）用于灵敏检测靶标 RNA，可在室温条件下稳定保存。该冻干剂型与其液体剂型 [ Luna® 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液（含 UDG）（NEB #M3019）] 具备同样卓越的性能和功效。
· 加入无核酸酶水即可快速复溶
· 未经复溶的冻干试剂，可室温储存长达 2 年
· 无需冷链运输
· 单次检测通量多达 5 个靶标
· Luna 温启动反转录酶与 Taq 热启动 DNA 聚合酶联合使用，提高反应特异性及功效
· 优化的预混试剂中包含热敏 UDG 和 dUTP，防止模板残留污染
· 预混试剂还含有小鼠 RNase 抑制剂，可保持 RNA 的完整性
· 非荧光蓝色示踪染料避免加样错误
· 与多种 qPCR 仪器兼容，包括需要高 ROX 或低 ROX 参比信号的仪器
LyoPrime Luna™ 探针一步法 RT-qPCR 预混冻干粉（含 UDG）可在室温条件下运输和保存。仅需加入无核酶水即可快速复溶并使用。该产品适用于水解探针法实时检测靶标 RNA。经优化可同时对高达 5 个靶标进行灵敏、线性的多重检测。稳定的冻干剂型可复溶成 2X 或 4X 浓度的预混液，以满足各种上样需求。
图 1：LyoPrime Luna 为冻干型通用 RT-qPCR 试剂，其性能卓越并可稳定保存
LyoPrime Luna™ RT-qPCR 预混冻干粉（NEB #L4001）与 Luna RT-qPCR 4X 预混液（NEB #M3019）具备相同的性能，该冻干剂型可在室温条件下运输和保存。
图 2：冻干型和液体型 Luna RT-qPCR 预混试剂具备同样优异的性能
A. 使用 LyoPrime Luna™ 探针一步法 RT-qPCR 预混冻干粉（含 UDG）(NEB #L4001) 或 Luna® 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液（含 UDG）(NEB #M3019) 对人 β-actin 靶标进行 RT-qPCR 检测，模板上样量为 8-log 浓度梯度（1 μg–0.1 pg Jurkat 总 RNA），每个浓度重复 4 次，使用 ABI® QuantStudio™ 6 Flex 仪器运行试验。反应体系（20 μl）中，引物浓度为 400 nM，探针浓度为 200 nM，反应设置为产品推荐的循环条件。B. 冻干试剂（金色）和液体试剂（蓝色）的标准曲线基本相同，即使在最低测试浓度下也展现出良好的线性度和重复性。
图 3：LyoPrime Luna 多重检测性能卓越
使用 LyoPrime Luna™ 探针一步法 RT-qPCR 预混冻干粉（含 UDG）对 6-log 浓度梯度的 Jurkat 总 RNA（1 μg-10 pg）进行多重 RT-qPCR，实验仪器为 Bio-Rad CFX96 荧光定量仪。结果显示了 5 个人源靶基因的扩增标准曲线和扩增效率。反应体系（20 μl）中，引物和探针浓度均为 200 nM，反应设置为产品推荐的循环条件。在该多重反应中，5 个靶标均检测到良好的线性度、扩增效率和 R2 值。
图 4：LyoPrime Luna 冻干剂型与其液体剂型性能一致，且优于其它品牌
上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。
75℃ 20 分钟。
