自噬荧光标记探针

Mitophagy Detection Kit

◆概要

　　Mitophagy Detection Kit是低分子荧光试剂的自噬检出试剂盒。通常情况下，观察自噬是需要pH传感器荧光蛋白在细胞中表达出来。但是，本试剂盒不需要荧光蛋白表达，通过简单操作便可观察自噬。

◆特点

　　●　使用低分子荧光试剂便可简便检出自噬

　　●　适用于荧光显微镜活细胞成像

　　●　通过和附带的溶酶染色试剂的联合染色，可以观察自噬

◆自噬（Mitophagy）是什么？

　　线粒体作为能量产生的场所，是在细胞中担当重要机能的细胞器。另一方面，积蓄的因氧化应激和DNA损伤等不良线粒体，是引发阿尔茨海默氏症和帕金森氏病的原因。

　　自噬是能选择性去除不良线粒体的系统。首先，通过自噬体将不良线粒体隔离，然后自噬体与溶酶体融合，线粒体被消化。

◆Mitophagy Detection Kit使用实例

　　通过使用Parkin表达HeLa细胞的carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP)的自噬诱导

图一：使用了Parkin表达HeLa细胞（上部分图片）和未表达HeLa细胞（下部分图片）的自噬观察

　　　　　　　　　　　　　　　　Ａ，Ｄ）：Mtphagy Dye的荧光图像

　　　　　　　　　　　　　　　　Ｂ，Ｅ）：Lyso Dye的荧光图像

　　　　　　　　　　　　　　　　Ｃ，Ｆ）：Mtphagy Dye和Lyso Dye的联合染色荧光图像

条件：

　　Mtphagy Dye：激发550 ± 25 nm、荧光发光605 ± 35 nm

　　Lyso Dye：激发470 ± 20 nm、荧光发光525 ± 25 nm

操作方法：

　　●　播种细胞，培养过夜

　　●　在细胞中导入使用了HilyMax [Code:H357]的Parkin质粒，培养过夜

　　●　使用Hanks’ HEPES缓冲液洗涤两次

　　●　添加100 nmol/l Mtphagy Dye working solution孵化30分钟

　　●　使用Hanks’ HEPES 缓冲液洗涤两次

　　●　在含有10 μmol/l CCCP的培养基培养24小时

　　●　通过荧光显微镜观察到发生自噬后，去除含有CCCP培养基，添加1 umol/l Lyso Dye working solution孵化30分钟

　　●　使用Hanks’ HEPES 缓冲液洗涤一次后，通过荧光显微镜观察被Mtphagy Dye和Lyso Dye联合染色。

◆Mtphagy Dye・Lyso Dye的激发光谱和荧光光谱

图2：Mtphagy Dye, Lyso Dye 的激发光谱和荧光光谱

　　Mtphagy Dye：激发550 ± 25 nm、荧光发光605 ± 35 nm

Lyso Dye：激发470 ± 20 nm、荧光发光525 ± 25 nm

脂肪酶催化的动态光学拆分法

V-MPS4

一般使用属于水解酶的脂肪酶的反应，只对外消旋体中其他的对映体发生反应，生成物的产量最多只有50%。

本产品是介孔二氧化硅中搭载氧钒化合物的催化剂。若与脂肪酶在相同的反应体系中使用，在外消旋醇中只能够得到一种产量100%的对映异构体。

◆实例^{2, 3）}

在合成抗菌剂（+）-Tanikoralide的不对称全合成的关键中间体（R）-4中的应用

与常规方法相比，合成(R)-4的步骤简单且产量高。

[ 1 ] Egi, M., Sugiyama, K., Saneto, M., Hanada, R., Kato, K. and Akai, S. :Angew. Chem. Int. Ed., 52, 3654 （2013）.

[ 2 ] 赤井周司 : 生産と技術, 66 , 57 （2014）.

[ 3 ] Fujioka, H., Matsuda, S., Horai, M., Fujii, E., Morishita, M., Nishiguchi, N., Hata, K. and Kita, Y. : Chem. Eur. J., 13 , 5238 （2007）.

识别天然形态的血清素转运蛋白

抗小鼠血清素转运蛋白，大鼠单克隆抗体（R5-3-2）

　　本产品是根据DNA免疫法建立的特异性识别天然形态的血清素转运蛋白的大鼠单克隆抗体。血清素转运蛋白是一种12回跨膜型的膜蛋白。有报道称，血清素运转蛋白可以调节与记忆，进食，睡眠等相关的羟色胺的量，并与精神疾病有关联。可确认它广泛存在于大脑的中缝核，大脑皮质，海马体等，且在末梢血小板中也有表达。

◆特点

●　可用于免疫组织染色

●　识别天然形态的血清素转运蛋白

◆产品概述

●　Clone NO.：R5-3-2

●　亚类：大鼠IgG_2a・K

●　交叉性：小鼠（未验证其他动物物种）

●　适用：流式细胞术（1：100~10,000）
        　 　免疫组织染色（1：100）

◆使用例

免疫组织染色

在实验的前额叶皮层中，血清素转运蛋白mRNA的表达呈阳性。

（数据提供:大阪大学牙科研究科 田熊老师，长谷部老师）

◆产品列表

◆相关产品

特异性标记、纯化ER驻留蛋白的试剂盒

ER-Protein Capture Kit

ER-Protein Capture kit是一款利用荧光标记物特异性标记ER驻留蛋白，再使用标签捕获抗体通过免疫沉淀法纯化标记蛋白的试剂盒。可用于ER相关蛋白的全面鉴定与定量分析有或无刺激（例如内质网应激）下靶蛋白的ER驻留量。

※　本产品是funakoshi基于京都大学工学研究科浜地格教授、田村朋则讲师的研究成果商品化销售的产品。

※　本产品仅供研究使用。研究以外不可使用。

◆ER蛋白的回收方法与问题点

ER （内质网；Endoplasmic Reticulum）是一种通常在细胞内占据约20%体积的细胞器，结构非常复杂且遍布整个细胞。ER是负责细胞内蛋白质生物合成的中央细胞器，在多肽链合成、通过伴侣蛋白适当折叠、排除异常蛋白等，从生物合成到品质管理中起着重要作用。ER还担任分泌路径的一部分，是细胞膜蛋白和细胞外分泌蛋白通过的细胞器。另外，它还被认为对于脂质代谢和脂肪滴形成十分重要，因此能够分离、鉴定并定量分析ER蛋白的方法备受期待。然而，不同于其他细胞器，特异性纯化ER的的技术十分贫乏，选择性回收ER蛋白并不容易。

ER Protein Capture Kit是由京都大学浜地格教授、田村朋则讲师等开发的基于ER驻留蛋白标记技术商品化的ER蛋白选择性标记、纯化试剂盒。通过使用ER驻留蛋白标记试剂ERM （ER-localizable Reactive Molecule），可以利用荧光标记物标记ER驻留蛋白，然后通过针对该标记物的特异性抗体进行纯化，选择性回收ER蛋白。无需超速离心机等特殊的机器，仅需简单操作便可纯化ER蛋白。除了能够通过蛋白组学进行全面鉴定外，本产品还适用于相对定量分析各种刺激处理下的ER驻留量。

◆试剂盒内容

本试剂盒由两部分组成。

A：ER驻留蛋白标记试剂ERM

A：（本试剂与产品名称为ERseeing、产品编号FDV-0038为同一试剂。可单独购买，也可以用作ER成像试剂）

B：标签捕获抗体（纯化兔多克隆IgG抗体）

A：※ 产品不包含用于细胞裂解液制备用的溶解缓冲液或免疫沉淀所需的Protein A / G树脂等。请另行购买。

◆原理和实验流程

ER驻留蛋白标记试剂ERM是一种在ER驻留性绿色荧光色素（Rhodol衍生物）上缀合蛋白标记基团的化合物。将ERM添加到活细胞后，由于色素部分的特性，显示出较高的ER驻留性。在ER中迅速浓缩后，通过蛋白标记基团用荧光标记物标记ER蛋白物（Step-1）。标记反应后破碎细胞制备细胞裂解液（Step-2），然后通过使用标签捕获抗体（抗Rhodol抗体）进行免疫沉淀（Step-3），可以选择性地回收被ERM标记的ER蛋白。由于回收的蛋白上带有荧光基团，使用SDS-PAGE分离后，可以通过CBB/银染或荧光成像仪检测出来（Step-4）。进行SDS-PAGE分离后，可以通过LC / MS进行全面蛋白组学分析或使用任何抗体的蛋白印迹法鉴定ER蛋白。

◆原著论文

Fujisawa et al., J. Am. Chem. Soc., 140, 17060～17070 (2018). Chemical Profiling of the Endoplasmic Reticulum Proteome Using Designer Labeling Reagents.

◆实验参考数据

■ ERM的激发/发射光谱

■ 激发光谱（蓝）以及发射光谱（绿）

■ ※ 适用于普通的绿色荧光色素FITC观察条件

■ ER特异性检验

■ 通过与各种细胞器标记共染色评价本试剂的ER特异性。观察到ERM（100 nM）与ER标记试剂高度共定位（皮尔逊相关系数>0.9）。另一方面，未观察到本试剂与溶酶体标记、线粒体标记的共定位。高尔基体标记观察到部分共定位，应该是因为本试剂所标记的蛋白通过Golgi体运输从ER转移至分泌路径。此外，添加ER-Golgi运输抑制剂的话，会减少与高尔基体的共定位（详细请参考原著论文）。

◆应用实例

通过蛋白组学全面分析回收蛋白

使用ERM (100 nM)处理HeLa细胞后，破碎细胞制备细胞裂解液。在裂解液中加入标签捕获抗体，使用Protein A磁珠进行免疫沉淀回收标记蛋白。将回收的蛋白通过SDS-PAGE分离后，切出每个条带，在凝胶中用胰蛋白酶/ Lys-C消化制备LC/MS样品。通过MS分析鉴定出共146种蛋白，其中63种蛋白是数据库上的ER蛋白，或是个别论文中确认了ER驻留的蛋白。73种蛋白作为细胞膜、细胞外分泌蛋白以及高尔基体蛋白被鉴定出来，它们都是存在于细胞外分泌路径的蛋白。由于存在于细胞外分泌途径的蛋白会途经ER，当这些蛋白在ER的时候便会被标记。因此，检测出来的蛋白中ER蛋白与途经ER的蛋白约占93%。本实验中检测出与ER无关的蛋白有10种，约占7%。

R应激引起的ER驻留蛋白变动量的定量评价

通过SILAC定量分析法分析ER应激诱导的ER驻留蛋白的变动量。准备两份细胞，一份在SILAC Heavy标记培养基中培养，另一份在Light标记培养基中培养。在Heavy标记培养基的细胞中添加ER应激诱导试剂Tunicamycin培养4 h。而Light标记培养基无需任何处理培养4 h。之后，使用ERM（100 nM）处理1 h，分别制备细胞裂解液，再以1:1的比例混合。通过免疫沉淀法回收混合裂解液中的标记蛋白，然后与上述实验一样，制备LC/MS用样品。检测出了87种可相对定量的蛋白，再通过SILAC法算出由ER应激引起的变动量。其中6种蛋白因ER应激在ER上的存在量增加了两倍以上。

新型瘦素竞争ELISA 试剂盒

　　Irisin 是由小鼠和人类骨骼肌分泌的表达最近的运动诱发激素。Irisin激活褐色脂肪细胞(褐色细胞的基因表达模式有别于白色或褐色的脂肪，优先对多肽激素Irisin敏感)。通过增加能量消耗，Irisin裂解成I型膜蛋白FNDC5，促进新陈代谢。现已得到证明，经过剧烈运动后，循环irisin水平会上调。在肥胖状况下，Irisin的增加可能是表示一种可提高葡萄糖耐量的生理机能。

◆特点

●　脂肪组织和肌肉组织都分泌的减肥新激素，运动和产热之间的信使

●　诱导白色脂肪变成褐色脂肪

●　增加燃烧脂肪的能量消耗和直接产热来提高新陈代谢

●　用于肥胖症研究，可改善生理功能，增加葡萄糖耐受

●　用于糖尿病研究，可控制血糖水平，消除胰岛素抵抗

◆图例

　　　　　　　标准曲线

◆产品

试剂盒

抗体

 相关产品

Betatrophin——新型胰岛素激素

脂肪细胞培养试剂盒

抗小鼠皮卡丘素，兔

Anti MousePikachurin, Rabbit

抗小鼠Sema4D/CD100，单克隆抗体

Anti Mouse Sema4D/CD100, Monoclonal Antibody

◆神经变性疾病相关的抗体

IL-6定量的最灵敏（0.057pg / mL）比色试剂盒

　　Enzo独特IL-6（人），高灵敏度ELISA试剂盒（产品编号：ENZ-KIT178-0001）能够定量检测微量IL-6。 IL-6高灵敏度ELISA试剂盒可以在培养上清液，血浆，血清和尿液中检测到低至0.057 pg / mL的IL-6。

　　白细胞介素-6（IL-6）是调节免疫系统和造血系统重要的细胞因子。 人IL-6由T细胞，肥大细胞，单核细胞，巨噬细胞，成纤维细胞，内皮细胞，角质形成细胞及许多肿瘤细胞系表达。在急性期反应、对损伤和炎症的反应中起作用。 人IL-6刺激B细胞分化以产生抗体，促进激活T细胞的扩增，扩大造血细胞产物生成，并诱导急性期蛋白的表达。

　　IL-6（人）高灵敏度ELISA试剂盒是比色免疫测定试剂盒，3小时内得到结果。在450nm读取吸光度。每96孔试剂盒测量多达40个样品。

IL-6高灵敏度ELISA试剂盒（ENZ-KIT178）标准曲线

◆特点

●　高灵敏度的ELISA实现微量IL-6量化。
●　操作方便的液体颜色编码试剂，减少失误。
●　3小时内快速定量获得结果。
●　高通量免疫检测可多达40个样品，一式两份（96孔试剂盒）。
●　即用型试剂和预涂板减少错误，节省时间。

瘦素ELISA试剂盒

◆原理

　　Leptin：瘦素(Leptin)是由  167  个氨基酸组成的一个蛋白，由白色脂肪组织分泌。瘦素作用于下丘脑减少食物摄取、减轻

体重、降低降低血液中糖和胰岛素的含量。人血浆中瘦素含量可以反映出组织脂肪重量。

◆优点、特色

●  简单快速

●  高特异性

●  超灵敏度

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Biostir® 特应性皮炎诱导剂AD