cAMP & cGMP 检测试剂盒

 cAMP & cGMP ELISA Kit

◆原理

　　环状核苷酸可作为G蛋白信号通道和钙离子信号通道的第二信使。

　　环状AMP（cAMP）是重要的第二信使，在很多生物学效应中起作用。已知大量激素通过能将ATP转变成cAMP的腺苷酸环化酶去激活cAMP。cAMP与血管疾病，神经系统，免疫，细胞生长和分化，代谢等有关。

　　环状GMP一般比cAMP的含量水平低10~100倍，鸟苷酸环化酶作用在GTP上形成cGMP。一些激素，比如乙酰胆碱，胰岛素，催产素和其他特定的化合物比如血清素，组胺会引起cGMP水平的升高。刺激鸟苷酸环化酶的化合物，比如血管舒张药硝普钠，硝化甘油，硝酸钠和一氧化氮会提高cGMP的含量。

　　相关疾病：心脏疾病，肿瘤，疼痛，哮喘，肥胖症，药物成瘾，精神疾病。

◆特点

　　●   兼容性好：可检测细胞裂解液，细胞培养上清，血清，血浆，唾液，组织或者尿液样品。可检测任意物种。

　　●   灵敏度高：优化的乙酰化步骤可以提高样品的检测灵敏度（可提高10倍）。

　　●   稳定性好：批次间的产品质量表现一致。

　　     可用于高通量筛选，3小时完成检测。

　　     简单，高效的样品处理步骤。

◆案例

　　检测小鼠视网膜裂解液

　　检测斑马鱼幼虫

　　检测软骨细胞匀浆液

　　检测N. benthamiana叶子抽提物

　　检测HUVEC细胞裂解液

　　检测大鼠肝脏组织

　　检测大鼠脑部匀浆液

cAMP  

cGMP

Q1：　乙酰化步骤是否是必须的？

A1：　如果样品中含有的cAMP或者cGMP浓度低或者想要提高检测灵敏度的话，样品需要进行乙酰化。乙酰化的

　　   灵敏度大概是非乙酰化的10倍多 。如果样品中的环状核苷酸的水平未知，推荐先检测几个样品（样品不进

　　   行乙酰化处理）。如果检测不到的话，样品进行乙酰化处理。

Q2：　是否可以用Complete ELISA试剂盒检测胞质中的cAMP/cGMP？

A2：　这些是比色法的ELISA试剂盒，定量检测任意物种的细胞裂解液，细胞培养上清，血清、唾液和组织样品

　　   （细胞内和细胞外的样品）的AMP/cGMP。

Q3：　我是否可用自己的裂解buffer（lysis buffer）?

A3：　当使用偶联物（conjunction）和中和试剂时，该试剂盒已经使用HCl裂解样品和稀释标准品。如果使用不

　　   同的buffer，并且用HCl稀释的话，反应的pH值不同（比如如果使用其他试剂，那么设计为了中和HCl的

　　   中和试剂不具有校对作用）。因此，为了优化结果，建议使用HCl进行细胞裂解和稀释。

Q4：　我样品中的cAMP/cGMP希望的浓度是多少？

A4：　样品中的cAMP/cGMP的量取决于样品的类型，来源甚至处理的方法。不幸的话，这个不是我们能够帮助

　　   您帮您预测的。建议使用者查找相关资料，在这些资料红，研究的是类似的样品，条件或者检测技术。

Q5：　用HCl处理的裂解液与哪些蛋白检测兼容？

A5：　最好先研究一下您希望使用的蛋白检测产品。比如，Pierc有不同的BCA检测试剂盒，在他们网站都有列出

　　   每个试剂盒兼容的试剂。我们建议直接和蛋白检测试剂的制造商或者销售商联系。他们应该可以提供相关

　　   解答。

Q6：　如果我的细胞在加入0.1M HCl后仍然没有裂解，该如何处理？

A6：　在使用0.1M HCl前，加入 Triton X-100（曲拉通 X-100）能够增加细胞或者组织的裂解。在这个浓度范围

　　   内使用，阴离子表面活性剂不会干扰乙酰化或者检测中结合的部分。然而，在最终检测OD值时，OD值会

　　   有一些增加。所以，含有Triton X-100的样品检测时，相应的标准品种也要添加Triton X-100。

Q7：　我需要使用多少样品？建议的稀释度是多少？

A7：　样品的用量和稀释度取决于样品中含有的cAMP/cGMP。建议客户可以参考相关的文章，该文章使用的是

　　   类似的样品类型，条件和检测技术。

Q8：　需要使用多少细胞？

A8：　组织的重量和细胞的数目完全取决于实验的条件。建议先测一两个样品，细胞的数目大概在2~5×106

　　   细胞/ml HCl。根据实验结果，有些样品可能需要进一步稀释。记住，稀释母液的方法比重新开始实验要容

　　   易些。

Q9：　是否可以用Direct ELISA试剂盒检测胞质的cAMP/cGMP？

A9：　该系列试剂盒可用于检测任意物种细胞或者组织裂解液的cAMP/cGMP。

Q10：　在用cAMP/cGMP ELISA或者cAMP/cGMP Complete ELISA试剂盒检测细胞培养上清的cAMP/cGMP

　　   时是否可以使用细胞培养基？

A10：　按照说明书所说，只要用含有分泌cAMP/cGMP的同样培养基稀释标准品。OD值上发生的细微变化与样品

　　   和标准品放置的板具有可比性。在研发这些试剂盒时，使用了cAMP/cGMP加样的含有酚红的PRMI1640

　　   和DMEM+Glutamax，OD值略有增加，样品也同样。建议优化自己的样品稀释度，对自己样品进行加样/

　　   回收测试，这样会得到更好的回收率和线性数据。

Q11：　乙酰化标准品和样品的最大结合率只有50%，为什么？

A11：　如果样品和标准品都已经乙酰化了，但是Bo标准品没有乙酰化的话，会出现上述情况。您的数据仍然是可

　　   用的。计算样品浓度的OD值，不计算%B/B0分析。

Q12：　哪些ELISA试剂盒能够检测胞质cAMP/cGMP？

A12：　Direct ELISA 试剂盒可以检测细胞内的cAMP/cGMP。如果想要检测胞内和细胞外的样品，可以使用

　　   complete ELISA试剂盒。

Q13：　是否可用这些试剂盒去研究激动剂和拮抗剂？

A13：　如果样品中的cAMP/cGMP符合试盒的检测范围，那么这些试剂盒可用于检测激动剂和拮抗剂引起的变化。

　　   当然，使用者最好建立样品中cAMP/cGMP 水平的基本线，优化激动剂和拮抗剂的处理。

Q14：　用assay buffer重悬后样品可以保存多久？

A14：　样品重悬后的稳定性不能评估。建议重悬后尽快使用。建议将样品保存在-80℃。

Q15：　干燥样品的话，如何处理？

A15：　使用真空离心（比如SpeedVac）或者氮气或者氩气进行干燥样品。如果样品多，建议使用真空离心的方

　　   法。样品可以在SpeedVac 室温放置过夜。第二天干燥，但是不能保证产品的完整性（因为不是在真空环

　　   境中保存样品）。

　　   用氮气干燥样品需要在气体末端使用玻璃枪头，将枪头正好悬在含有你样品的管子内。如果使用这个方

　　   法，建议首先在含有石油醚的管子上操作，确定操作流程的时间。

Q16：　用cAMP ELISA试剂盒Assay buffer稀释的样品，是否可用cGMP ELISA 试剂盒检测？

A16：　这两个试剂盒的Assay Buffer的货号是一样的，所以产品都是一样的。如果使用试剂盒其他所有组分，样

　　   品也没有问题。

Q17：　我是否可以保存乙酰化样品一段时间，晚点再测？

A17：　不。我们建议马上检测的样品才进行乙酰化处理。样品不添加试剂进行乙酰化处理时更稳定。

Q18：　我细胞的样品检测后数值不是很一致。我认为我的细胞可能穿孔了。

A18：　为了获得更一致的结果，我们建议检测时用裂解液彻底破坏细胞。由于细胞的厚度不一，建议用显微镜检

　　   查一下。

Q19：　需要使用多少assay buffer去重悬我的血清样品？

A19：　重悬样品的assay buffer体积完全取决于具体的实验情况。我们建议1mL assay buffer重悬1mL血清，然

　　   后进行一定的稀释。

Q20：　考虑到板子是用抗兔的IgG包被的，是否可用来检测兔血清的cAMP/cGMP？

A20：　该试剂盒提供的板子包被的是能够捕获cAMP/cGMP的通用抗体。试剂盒使用的山羊抗兔IgG的抗体，意味

　　   着含有高内源性IgG的兔样品会引起干扰，影响cAMP/cGMP的检测。如果必须检测这些样品，我们推荐在

　　   检测之前使用MWCO过滤或IgG去除试剂盒。请注意，我们没有测试过上述方法，也不能提供相关实验流程。

◆cAMP

 cAMP complete ELISA kit

Product Literature References

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Hepatic ANGPTL3 regulates adipose tissue energy homostasis: Y. Wang, et al.; PNAS 112, 11630 (2015), Application(s):ELISA using mouse tissue homogenate, Abstract; Full Text

Misoprostol modulates cytokine expression through a cAMP pathway: Potential therapeutic implication for liver disease: L. Gobejishvili, et al.; Cell Immunol. 6616, 30041 (2015), Application(s): ELISA kits quantifying cell lysates, Abstract;

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cGMP inhibition of type 3 phosphodiesterase is the major mechanism by which C-type natriuretic peptide activates CFTR in the shark rectal gland: H.R. De Jonge, et al.; Am. J. Physiol. Cell Physiol. 306, C343 (2014), Application(s): ELISA using dogfish shark supernatant, Abstract; Full Text

A role for GPRx, a novel GPR3/6/12-related G-protein coupled receptor, in the maintenance of meiotic arrest in Xenopus laevis oocytes: D. Ríos-Cardona, et al.; Dev. Biol. 317, 380 (2008), Application(s): EIA using xenopus cell lysates,Abstract;

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cAMP complete ELISA kit

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Direct cAMP ELISA kit

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Cyclin-dependent kinase 5 in the ventral tegmental area regulates depression-related behaviors: P. Zhong, et al.; J. Neurosci. 34, 6352 (2014), Application(s): EIA using mouse ventral tegmental area (VTA) homogenates, Abstract; Full Text

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Low concentrations of metformin suppress glucose production in hepatocytes through AMP-activated protein kinase (AMPK): J. Cao, et al.; J. Biol. Chem. 289, 20435 (2014), Abstract;

Prostaglandin E2 promotes features of replicative senescence in chronically activated human CD8+ T cells: J.P. Chou, et al.; PLoS One 9, e99432 (2014), Application(s): EIA using cell culture supernatants, Abstract; Full Text

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Three intragenic suppressors of a GTPase-deficient allele of GNAS associated with McCune-Albright syndrome: K. Turcic, et al.; J. Mol. Endocrinol. 52, 321 (2014), Abstract;

Age-dependent alterations in cAMP signaling contribute to synaptic plasticity deficits following traumatic brain injury: D.J. Titus, et al.; Neuroscience 231, 182 (2013), Application(s): EIA using rat cortex, hippocampus and thalamus homogenates, Abstract; Full Text

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Does 4-tert-octylphenol affect estrogen signaling pathways in bank vole Leydig cells and tumor mouse Leydig cells in vitro?: M. Kotula-Balak, et al.; Reprod. Toxicol. 39, 6 (2013), Abstract;

Liraglutide protects against amyloid-β protein-induced impairment of spatial learning and memory in rats: W.N. Han, et al.; Neurobiol Aging 34, 576 (2013), Application(s): EIA using rat brain homogenates, Abstract;

Molecular mechanisms underlying the rapid arrhythmogenic action of bisphenol A in female rat hearts: X. Gao, et al.; Endocrinology 154, 4607 (2013), Application(s): EIA using rat myocyte homogenates, Abstract; Full Text

Resveratrol prevents β-cell dedifferentiation in nonhuman primates given a high-fat/high-sugar diet: J.L. Fiori, et al.; Diabetes 62, 3500 (2013), Application(s): EIA using CHO cell supernatant, Abstract; Full Text

Role of AKAP79/150 protein in b1-adrenergic receptor trafficking and signaling in mammalian cells: X. Li, et al.; J. Biol. Chem. 288, 33797 (2013), Application(s): ELISA using murine cardiomyocytes, Abstract;

Rolofylline, an adenosine A1 receptor antagonist, inhibits osteoclast differentiation as an inverse agonist: W. He, et al.; Br. J. Pharmacol. 170, 1167 (2013), Application(s): EIA using bone marrow macrophage lysates (acetylated samples),Abstract; Full Text

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Drugs developed to treat diabetes, liraglutide and lixisenatide, cross the blood brain barrier and enhance neurogenesis: K. Junter & C. Hölscher ; BMC Neurosci. 13, 33 (2012), Application(s): ELISA analysis of mouse brain tissue, Abstract;Full Text

Liraglutide, a long-acting GLP-1 mimetic, and its metabolite attenuate inflammation after intracerebral hemorrhage: J. Hou, et al.; J. Cereb. Blood Flow Metab. 32, 2201 (2012), Application(s): ELISA analysis of mouse brain tissue, Abstract;Full Text

Pharmacological validation of Trypanosoma brucei phosphodiesterases as novel drug targets: H.P. de Koning, et al.; J. Infect. Dis. 206, 229 (2012), Application(s): EIA using Trypanosoma lysates, Abstract; Full Text

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Acylated and unacylated ghrelin attenuate isoproterenol-induced lipolysis in isolated rat visceral adipocytes through activation of phosphoinositide 3-kinase γ and phosphodiesterase 3B: A. Baragli, et al.; Biochim. Biophys. Acta 1811, 386 (2011), Application(s): EIA using rat adipocyte extracts, Abstract;

Characterization of the differential response of endothelial cells exposed to normal and elevated laminar shear stress: S.J. White, et al.; J. Cell. Physiol. 226, 2841 (2011), Application(s): ELISA using HUVEC, Abstract; Full Text

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FMRP acts as a key messenger for dopamine modulation in the forebrain: M. Zhao, et al. ; Neuron 59, 634 (2008),Application(s): EIA using mouse cell lysates, Abstract;

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◆cGMP

cGMP ELISA kit

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cGMP complete ELISA kit

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Direct cGMP ELISA kit

Product Literature References

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Nitric oxide synthase-3 promotes embryonic development of atrioventricular valves: Y. Liu, et al.; PLoS One 8, e77611 (2013), Application(s): EIA using mouse cardiac tissue, Abstract; Full Text

Sestrin 2 and AMPK connect hyperglycemia to Nox4-dependent endothelial nitric oxide synthase uncoupling and matrix protein expression: A. Eid, et al.; Mol. Cell. Biol. 33, 3439 (2013), Application(s): EIA using rat glomerular mesangial cells,Abstract; Full Text

β-Sitosterol oxidation products attenuate vasorelaxation by increasing reactive oxygen species and cyclooxygenase-2: C. Yang, et al.; Cardiovasc. Res. 97, 520 (2013), Application(s): ELISA using rat aortic tissue, Abstract; Full Text

Chronic deficiency of nitric oxide affects hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) stability and migration in human endothelial cells: M.G. Cattaneo, et al.; PLoS One 6, e29680 (2011), Application(s): EIA using human cell lysate, Abstract; Full Text

cGMP secreted from the tapeworm Hymenolepis diminuta is a signal molecule to the host intestine: N. Zimmerman, et al. ; J. Parasitol. 94, 771 (2008), Application(s): EIA using tapeworm culture supernatants, Abstract;

Evidence for functional heterogeneity of circulating B-type natriuretic peptide: A. Protter, et al. ; J. Am. Coll. Cardiol. 49, 1071 (2007), Application(s): EIA using human cell lysates, Abstract;

Estradiol and progesterone modulate the nitric oxide/cyclic gmp pathway in the hypothalamus of female rats and in GT1-1 cells: H.P. Chu, et al. ; Endocrine 24, 177 (2004), Application(s): EIA using rat cell lysates, Abstract;

A Novel PDZ Protein Regulates the Activity of Guanylyl Cyclase C, the Heat-stable Enterotoxin Receptor: R.O. Scott, et al. ; J. Biol. Chem. 277, 22934 (2002), Application(s): EIA using monkey cell lysates, Abstract;

The Mechanism of Ciliary Stimulation by Acetylcholine: Roles of Calcium, PKA, and PKG: O. Zagoory, et al. ; J. Gen. Physiol. 119, 329 (2002), Application(s): EIA using frog cell lysates, Abstract;

Differential nitric oxide synthase activity, cofactor availability and cGMP accumulation in the central nervous system during anaesthesia: H.F. Galley, et al. ; Br. J. Anaesth. 86, 388 (2001), Application(s): EIA using rat cell lysates, Abstract;

Mechanism underlying diuretic effect of L-NAME at a subpressor dose: M. Liang, et al. ; Ren. Physiol. 281, F414 (2001),Application(s): EIA using rat microdialysate, Abstract; Full Text

The plasma membrane calmodulin-dependent calcium pump: a major regulator of nitric oxide synthase I: K. Schuh, et al. ; J. Cell Biol. 155, 201 (2001), Application(s): EIA using human cell lysates, Abstract;

Role of cGMP versus 20-HETE in the vasodilator response to nitric oxide in rat cerebral arteries: C.W. Sun, et al. ; Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279, H339 (2000), Application(s): EIA using rat cell lysates, Abstract;

Increased cerebrospinal fluid cAMP levels in Alzheimer's disease: M. Martinez, et al. ; Brain Res. 846, 265 (1999),Application(s): EIA using human cerbrospinal fluid, Abstract;

重组胰蛋白酶（RTrypsin）

◆概述

胰蛋白酶（Trypsin; EC 3.4.21.4）是一种丝氨酸蛋白酶，酶解赖氨酸及精氨酸C末端形成的肽键。重组猪胰蛋白酶是由毕赤酵母重组表达并采用层析色谱法纯化获得。氨基酸序列与猪胰腺来源的阳离子型胰蛋白酶完全一致，分子量为24 kDa，最适pH为7.0-9.0。可替代猪胰腺来源胰蛋白酶应用于各种生物技术过程中，如：重组胰岛素生产；细胞培养、细胞发酵；蛋白质的酶解、测序；各种组织的细胞分离等。活性受丝氨酸蛋白酶抑制剂如TLCK、PMSF等的抑制，金属离子螯合剂如EDTA等抑制酶活。

◆优势

●　批量生产规模大，批间小

●　高纯度，高比活性

●　重组表达生产，无外源性病毒污染，生产过程不使用动物来源原料

◆纯度

SDS-PAGE显示纯度＞95%。

◆来源

重组毕赤酵母菌株，其克隆有来自猪的胰腺来源阳离子型胰蛋白酶基因。

◆使用方法

保存：10 mmol/L HCl，20 mmol/L CaCl2；溶解后分装-15 ℃以下保存。

酶切体系：25 mmol/L Tris-HCl , pH 7.6~8.0。

推荐使用量：蛋白酶：融合蛋白质量比1：20~1：100（肽图或蛋白组学研究），

推荐使用量：1：200~1：2000（多肽/蛋白生产工艺）。

◆保存条件

储存稳定性：冻干粉存于-15 ℃以下，24个月稳定；10 mmol/L HCl，20 mmol/L CaCl₂溶解后分装储存于

储存稳定性：-15 ℃以下，反复冻融5次，未能观察到活性损失；溶解后2~8 ℃保存建议不超过7 d。

运输稳定性：冰袋保温运输，活性稳定

◆应用实例

RTrypsin特异性酶切合成短肽

合成多肽序列YGKRLWK,理论酶切位点酶切产物YGKR、LWK、YGK、R、RLWK，蛋白酶：合成多肽质量比1：100，37 ℃酶切反应10 min，LC-MS验证酶切反应特异性。

◆产品信息

◆相关产品

由人I型胶原蛋白重组多肽形成的新型细胞支架

Cellnest μ-piece

Cellnest μ-piece是由人I型胶原蛋白重组多肽经过交联处理所形成的、具有特殊结构的细胞支架。

使用时仅需与细胞混合，就可装配成可防止细胞团中心发生坏死的三维细胞结构体（CellSaic），可应用于细胞移植实验。

◆特点

何谓Cellnest

Cellnest是一种以不含有任何动物源成分的酶所产生的重组多肽，由FUJIFILM开发。

其序列不含人I型胶原抗原部位，因此容易被生物体吸收分解。

细胞与独特花瓣形结构的微片混合培养，可形成三维细胞结构体

高细胞存活率

■　in vitro LIVE/DEAD染色

LIVE：Calcein（绿）    DEAD：EthD-1（红）

在hMSC制作的多细胞球状体中可观察到散布的死细胞；用μ-piece制作的CellSaic中，可观察到很多活细胞。

■　in vitro ATP assay (Day 7)

在hMSC（2×10⁴ cells）中进行ATP定量。从图示中可看到与Spheroid的存活率相比，CellSaic的存活率高约2倍。

细胞存活率高，可应用于细胞移植。微片易于被生物体分解、吸收，是安全型的材料（胶原蛋白重组多肽）

大鼠模型由于大脑动脉阻塞引起右脑梗塞，在其梗塞的部位局部移植入CellSaic（BMSC+μ-piece）。将计算左转行动次数并进行评价，作为症状改善的简单指标。

与仅投与细胞悬液相比，可确认移植进CellSaic对左转行动有改善效果。

◆Cellnest μ-piece制作的CellSaic是什么

●　在细胞球状体中紧密嵌入细胞支架，抑制细胞死亡

●　移植后易于血管导入

细胞球状体

400 μm以上厚度的细胞团，从中心位置开始细胞出现死亡（中心坏死）

CellSaic

以细胞支架与细胞间的间隙，或者是细胞支架自身作为氧气、营养、废弃物的通道

CellSaic制作步骤概要

将μ-piecec（0.1 mg/mL）和细胞（1.0×10⁵ cells/mL）的悬液按照200 μL/well加入96孔U型吸附处理板进行培养。用板式离心机进行离心（600 g×5 min），CO₂ 孵育（37℃）1~2日，即可完成。

◆产品列表

请点击文字，浏览相关产品：cellnest溶液型（用于细胞培养时包被）

更多详细信息请点击文字下载PDF：Cellnest μ-piece

自噬研究用抗体

◆兔抗大鼠LC3

　　LC3是芽殖酵母自噬相关蛋白Atg8的哺乳类类似物。LC3在细胞质上合成后，切除C末端形成LC3-I。LC3-I与E1样泛素连接酶Atg7、E2样泛素连接酶Atg3携带的磷脂结合形成LC3-II。LC3-II结合形成自噬膜型。因此，LC3被用做自噬的标志物之一。本产品可同时识别LC3-I、LC3-II。

●　形状：抗血清。不含防腐剂、稳定剂

●　抗原：合成肽，与大鼠LC3B的氨基酸序列5-18 相当

●　特异性：与人、大鼠、小鼠LC3B反应

　　实际稀释倍率：免疫细胞化学 1:200~500（共聚焦显微镜）

　　Western blotting 1:500~5,000

●　推荐稀释缓冲液：1％ BSA in 20mmol/l Tris-HCl（pH 7.5）, 0.15mol/l NaCl, 0.1％ NaN₃

　　※　背景较高情况下，请使用加了0.1%Tween20的稀释缓冲液。

小鼠MEF提取液Western blotting

HeLa细胞的荧光染色

◆兔抗SQSTM1/A170/p62

　　SQSTM1/A170/p62是泛素结合蛋白，氧化应激反应依赖性表达。SQSTM1/A170/p62的异常化，会导致骨代谢异常、肥胖、2型糖尿病等。近来有报道称SQSTM1/A170/p62可与自噬相关因子LC3结合，因此在诱导泛素/蛋白酶体系到自噬系的蛋白质分解方面备受关注。

●　形状：大肠杆菌蛋白质吸收后，2倍稀释的抗血清。防腐剂含0.1%的NaN₃。

●　抗原：小鼠SQSTM1（A170）的氨基酸序列254-333重组体（N末端含T7tag，C末端含His tag）

●　特异性：与大小鼠SQSTM1（A170/ZIP）反应；与人SQSTM1（A170/ZIP）反应极弱。

●　实际稀释倍率：Western blotting  1:200；

　　免疫组织染色  1:1,000

　　免疫荧光染色  1:1,000

小鼠MEF提取液的Western blotting

◆兔抗人Atg7

　　Atg7是自噬反应中形成自噬体所必须的基因之一。能与泛素样蛋白质Atg8和Atg12结合的E1样泛素连接酶。

●　形状：抗血清。不含防腐剂和稳定剂

●　抗原：与人Atg7的氨基酸序列556-571相当的合成肽

●　特异性：与人、大鼠、小鼠的Atg7反应

●　实际稀释倍率：Western blotting  1:1,000~5,000

●　推荐稀释缓冲液：1％ BSA in 20mmol/l Tris-HCl（pH 7.5）, 0.15mol/l NaCl, 0.1％ NaN₃
　　※　背景较高的情况下，请使用加入0.1% Tween20的稀释缓冲液。

◆相关产品

自噬活性化因子

自噬抑制剂

参考文献

1). Ishii, T., et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun., 226, 456(1996).

2). Ishii, T., et al.: J. Biol. Chem., 275, 16023(2000).

3). Komatsu, M., et al.: Cell, 131, 1149(2007).

4). Nakaso, K., et al.: Brain Res. Mol. Brain Res., 69, 155(1999).

5). Jiang,P.,et al.: Methods,75,13(2015).

癌症研究相关试剂

EGFR酪氨酸激酶抑制剂——吉非替尼

　　吉非替尼是表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶的选择性抑制剂。EGFR在癌细胞中过量表达，与癌细胞的增殖相关，因此EGFR酪氨酸激酶抑制剂可作为癌症治疗药物。吉非替尼通过抑制EGFR酪氨酸激酶自身磷酸化，阻碍癌细胞增殖相关信号通路，从而达到抑制癌细胞增殖的效果。对比野生型EGFR，吉非替尼能够实现更低浓度地抑制变异型EGFR的活性。

◆产品概要

●　外观：白色～浅褐色、结晶性粉末～粉末 ●　二甲亚砜溶液：适合实验 ●　含量（HPLC）：98.0%以上 ●　CAS  No. ：184475-35-2 ●　C22H24ClFN4O3=446.90 ●　IC50=0.033μmol/L(in vitro, A431膜组分)1）

◆相关产品

EGFR酪氨酸激酶抑制剂

1.　Wakeling, A. E., Guy, S. P., Woodburn, J. R., Ashton, S. E., Curry, B. J., Barker, A. J. and Gibson, K. H. :

1.　 Cancer Res., 62, 5749(2002).

2.　Lynch, T. J., Bell, D. W., Sordella, R., Gurubhagavatula, S., Okimoto, R. A., Brannigan, B. W., Harris, P. L.,

2.　Haserlat, S. M., Supko, J. G., Haluska, F. G., Louis, D. N., Christiani, D. C., Settleman, J. and Haber, D. A. :

2.　N. Engl. J. Med., 350, 2129(2004).

细胞水平氧化应激标记物丙烯醛的检测试剂

AcroleinRED

本试剂能与剧毒的不饱和醛——丙烯醛进行特异性反应，并通过红色荧光使其可视化。它不和其他不饱和醛或脂质代谢物等进行反应，因此可以从活细胞中检测出内源性丙烯醛或由外部刺激而过量产生的丙烯醛，并且可进行相对定量。

※本产品基于理化学研究所开拓研究本部田中生体机能合成化学实验室的研究成果商品化而成。

※ 本产品仅供研究用。请勿用于研究以外的其他用途。

◆丙烯醛是什么？

丙烯醛（Acrolein；2-propenal）是具有最简单结构的α，β不饱和醛。因其化学活性高，近年来作为氧化应激标记备受瞩目。丙烯醛的产生源十分广泛，具体可分为环境因素和生理因素。已知的环境因素有：烹饪食品时可能产生丙烯醛（特别是油炸肉或鱼，烘烤或烧焦时等等），以及饮酒、香烟中的烟雾、排气导致丙烯醛的生成（燃烧有机物）等。另外，在生理因素方面，有报道称丙烯醛在生物体内经常作为代谢副产物被合成，如在脂质过氧化反应，苏氨酸和蛋氨酸的酶依赖性代谢反应，多胺氧化反应以及由于细胞暴露而产生的氧化应激反应。

由于丙烯醛的化学反应活性非常高，它能与生物体内各种亲核基团结合（蛋白质、核酸和脂质等），从而破坏其功能，因此它作为一种具有强毒性的氧化应激标记物开始为人们认知。近年研究表明，丙烯醛的毒性高于最有名的氧化应激标记物，活性氧（Reactive Oxidative species；ROS）。它不仅在基础生物学，在制药、环境科学、食品产业、健康产业等广泛地生命科学领域中也备受瞩目。然而，由于丙烯醛结构简单且反应活性高，导致其检测困难且难以对它进行详细分析。

丙烯醛的结构式

■　传统的丙烯醛检测方式

在传统法中，想要检测丙烯醛十分困难，通常会利用丙烯醛的α，β-不饱和醛结构的化学反应进行检测。以下列举两种具有代表性的方法。

1）检测FDP

丙烯醛能与生物体内蛋白的胺缓慢反应，生成3-甲酰基-3,4-脱氢哌啶（FDP）。通过使用能识别FDP的抗体，间接检测并定量丙烯醛的方法得到广泛应用。然而，有研究人员提出了该方法的缺点：①毕竟FDP只是众多丙烯醛反应物中的一种，凭借抗FDP抗体对丙烯醛的评价并不充分；②由于 FDP的生成十分缓慢，无法在高灵敏度下观察丙烯醛的生成。另外，由于使用抗体，因此不适用于活细胞实验（见上图方法一）。

2）利用HPLC检测

通过使用3-氨基丙醇与丙烯醛发生选择性的荧光反应，然后使用HPLC荧光分析对具有荧光性的生成物7-羟基喹啉进行定量。但是由于丙烯醛的高活性和挥发性，无法轻易将其分离，生成物的荧光灵敏度低、通量低，且无法避免细胞破裂，无法检测活细胞的丙烯醛含量（见上图方法二）。

◆AcroleinRED的原理

AcroleinRED是利用了理化学研究所田中克典主任研究员等人所发现的苯基叠氮化合物与丙烯醛发生特异性环化反应时所用到的试剂。

■　苯基叠氮化合物丙烯醛的特异性反应

苯基叠氮化合物与丙烯醛特异性地且迅速地发生反应，生成环状产物4-甲酰基1,2,3-三唑啉。4-甲酰基1,2,3-三唑啉能与附近的生物分子非特异性结合并形成共价键。

■　利用AcroleinRED检测丙烯醛的原理

利用AcroleinRED检测丙烯醛的原理可以分为细胞内外两条途径。

①检测细胞内丙烯醛

AcroleinRED拥有膜通透性，能够穿透细胞膜，在细胞内与丙烯醛反应并形成4-甲酰基1,2,3-三唑啉。

②检测释放到细胞外的丙烯醛

细胞膜脂质过氧化反应所产生的丙烯醛被释放到细胞外。丙烯醛与细胞外的AcroleinRED迅速反应，反应生成物4-甲酰基1,2,3-三唑啉通过胞吞进入到细胞中。

无论是①，②哪条途径的反应生成物4-甲酰基1,2,3-三唑啉，都会随机地与生物分子（蛋白等）反应，最后在细胞内将细胞染色。

※    请注意，本试剂不能用于局部观察。由于丙烯醛与试剂的反应生成物以及附加在生物分子的状态都会通过荧光

※    信号被检测出，因此并不能使丙烯醛局部可视化。

◆特点

●　AcroleinRED是利用了苯基叠氮化合物与丙烯醛特异性且迅速发生反应这一原理的试剂。通过使用TAMRA染料

●　标记从细胞中产生的丙烯醛，使丙烯醛可视化。

●　可使用罗丹明滤光片组件观察（激发/荧光波长：560 nm/585 nm）。

●　不与其他不饱和醛（巴豆醛，反式2-辛烯醛，异丁烯醛）、苯乙烯反应。

●　无需前处理，简单地操作即可检测。

●　与现有丙烯醛定量法相比，灵敏度高。（丙烯醛浓度的检测上限：100 nM）

●　可根据荧光强度相对定量丙烯醛。

◆原著论文

●　A. R. Pradipta, M. Taichi, I. Nakase, E. Saigitbatalova, A. Kurbangalieva, S. Kitazume, N. Taniguchi,

●　K. Tanaka, ACS Sens., 1, 623～632 (2016).

●　Uncatalyzed Click Reaction between Phenyl Azides and Acrolein: 4-Formyl-1,2,3-Triazolines as

●　“Clicked” Markers for Visualizations of Extracellular Acrolein Released from Oxidatively Stressed

●　Cells.

●　T. Tanei, A. R. Pradipta, K. Morimoto, M. Fujii, M. Arata, A. Ito, M. Yoshida, E. Saigitbatalova, A.

●　Kurbangalieva, J. Ikeda, E. Morii, S. Noguchi, and K. Tanaka, Adv. Sci., 1801479 (2018)

●　Cascade reaction in human live tissue allows clinically applicable diagnosis of breast cancer

●　morphology.

◆应用

●　稳态下对丙烯醛产生量进行相对定量

●　对因外部刺激（药剂处理等）导致丙烯醛产生量变动进行相对定量

※    不可用于丙烯醛的局部观察。详情请浏览本文“原理”部分。

◆操作方法概要

1.　使用新鲜的培养基制备AcroleinRED溶液（终浓度10~30 μM）。

1.　※ 终浓度可能会因为细胞种类不同而有所差别，建议根据实验进行优化。

2.　去除培养细胞的培养基，用PBS清洗2次。

3.　添加含有AcroleinRED的培养基。

4.　培养30分钟~1小时。

1.　※ 注意：荧光信号会随处理时间的增加而积累。请根据实验选择最优的处理时长。

5.　用PBS清洗细胞3次，更换新的培养基。

6.　可以观察非固定细胞（活细胞）及固定细胞。

◆应用实例

■　验证苯基叠氮化合物的丙烯醛特异性

■　依赖于氧化应激的丙烯醛的产生量增加

在氧化应激模型中，将0~1，000 μM的各浓度的过氧化氢H₂O₂添加至HUVEC细胞中预孵育2小时后，添加AcroleinRED并在30分钟后进行非固定观察。在未添加H₂O₂时可观察到稳态下丙烯醛的产生量。另外，可以发现随着H₂O₂浓度的增加，丙烯醛的生成量也不断增加。

■　ROS产生促进剂使丙烯醛产生量增加

使用能促进细胞内活性氧（ROS）产生的物质甲萘醌对细胞处理0、10、30、60分钟后，分别使用ROS检测试剂以及AcroleinRED进行共染色。可观察到经甲萘醌处理后，细胞的ROS迅速增加，而丙烯醛则是缓慢增加。

■　不同细胞种类所产生的丙烯醛产生量比较

使用AcroleinRED对3种正常细胞以及8种人癌细胞株进行丙烯醛产生量的相对比较。结果表明，与正常细胞相比，癌细胞中丙烯醛的产生量明显增加。并且发现每种癌细胞的丙烯醛的产生量之间也有差别。

■　组织中丙烯醛的可视化

将乳腺癌患者来源乳腺组织（IDC，浸润性导管癌, DCIS，原位导管癌）以及正常乳腺组织（NBG）提取后立刻以非固定状态浸于AcroleinRED（20 μM）/Hochest混合溶液中，静置5分钟后染色丙烯醛和细胞核，清洗组织后使用荧光显微镜观察。

结果表明，AcroleinRED处理过的乳腺癌组织（IDC，DCIS）中可以观察到红色荧光，但正常乳腺癌组织（NBG）却基本无法观察到经过AcroleinRED处理的染色。通过这种方法，可以对非固定状态下的提取组织进行染色。

参考文献

StemRNA^TM 重编程试剂盒

Stemgent^® StemRNA^TM SR Reprogramming Kit

◆产品概况

ReproCELL的 Stemgent^® StemRNA™ -SR 重编程试剂盒是首个细胞重编程试剂盒，结合自身复制RNA（srRNA）和microRNA技术，为干细胞研究者提供安全、灵活、快速、经济、高效重编程，可将来自人外周血、脐带血、人成熟和新生成纤维细胞的内皮祖细胞（EPCs）通过重编程转化为IPS细胞。

该试剂盒有3种组分                                             

●　OKSiM-srRNA

●　microRNA 重编程混合物

●　18R重组蛋白

◆优势

●　重编程来自人外周血或者脐带血的EPCs的实验流程经过鉴定。

●　不含病毒或DNA的OKSiM重编程因子，包括自我复制RNA。

●　两种转染流程，免除了条件性培养基、共转染、小分子和饲养层细胞的需求。

●　25天内制备来自EPCs和成纤维细胞的iPS细胞克隆。

●　流程可在6孔板内进行5种重编程。

表 1. 来自人血液样品的EPCs进行有效的细胞srRNA重编程

来自外周血的原代EPC建立效率是新鲜血液和冻存的单核细胞（MNC）样品的累加。脐带血效率的数据只是来自冻存的MNCs。每种胶原被的T-75瓶最少接种5 x 10⁷ MNCs。未修饰 StemRNA-SR试剂盒步骤证明使用一个重编程实验即可得到病人之间的高效率。典型的最终结果是6孔板内每个孔有10~20个iPS细胞克隆。

◆相关产品

注：本品已停产，升级版本已推出：Stemgent® StemRNA™ 3rd Generation Reprogramming Kit（又名 StemRNA-NM Reprogramming Kit，产品编号：00-0076）。

试剂盒组分

●　OKSiM-srRNA, (Part No. 05-0038), 5 µg, 1 瓶

●　microRNA Reprogramming Cocktail (20 µM) (Part No. 05-0036), 35 µL, 1 瓶

●　B18R Recombinant Protein, Carrier-Free (Cat. No. 03-0017), 50 µg, 1 瓶

保存

●　保存和保质期Storage and Stability

●　所有组分均保存在-70 °C及其以下

●　到货后至少保存3个月

质量控制

StemRNA™-SR Reprogramming Kit可以重编程人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。重编程的iPS细胞克隆用多能干细胞标志物和细胞形态进行鉴定。所有成分均经过灭菌，不含支原体。Limited Use Licenses

Limited Use License MIT
Limited Use License iPS Academia Japan

This product also uses technology licensed from the University of California – San Diego.

推荐使用

建议使用StemRNA-SR制备EPC重编程成为iPS.

●　制备EPC需要的材料清单-点击

●　i StemRNA-SR 重编程要的材料-点击

●　ISSCR 2015 （Stockholm）海报: ISSCR2015-srRNA-mobile.pdf

Specification Sheets

00-0075 Product Specification Sheet

Safety Data Sheets

03-0017 Safety Data Sheet

05-0036 Safety Data Sheet

05-0038 Safety Data Sheet

Product Sheets

00-0075 Product Sheet

　[1]　 Yoshioka N; Gros E; Li H-R; Kumar S; Deacon DC; Maron C; Muortri AR; Chi NC; Fu X; Yu BD; Dowdy 

   　SF. "Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA." Cell Stem Cell 13:

       246 (2013)

　[2]　 Geti I; Ormiston M: Touhain F; Toshner M; Movassagh M; Nichols J; Mansfield W; Southwood M; 

             Bradley A; Rana AA; Vallier L; Morrell NW. "A practical and efficient cellular substrate for the

            generation of induced pluripotent stem cells." Stem Cells Trans med 1:855 (2012)

　[3]　  Yoshida Y; Takahashi K; Ishisaka T; Yamanaka S. "Hypoxia Enhances the Generation of Induced　

                Pluripotent Stem Cells." Cell Stem Cell 5:237 (2009)

KY03-I

无蛋白 心肌细胞诱导化合物

　　有报道指出KY0211是把人ES/iPS细胞分化诱导至心肌细胞的化合物。KY03-I浓度（3μmol/L）比KY02111浓度更低，可更高效地分化为心肌细胞。

　　虽然人ES/iPS细胞分化诱导成心肌细胞的分化诱导法被多次报道，但因使用血清、动物蛋白质和高价的细胞因子，所以有感染风险和成本压力。

　　若使用如本品的KY化合物，无需使用血清、蛋白质、细胞因子等，则能比传统方法更高效地将人ES/iPS细胞分化诱导成心肌细胞。

　　为了在细胞培养过程中，使用更加简捷，本品已进行内毒素、支原体检测处理。

◆产品概要：

【参考文献】

[1]: Minami, I., Yamada, K., Otsuji, T. G., Yamamoto, T., Shen, Y., Otsuka, S., Kadota, S., Morone, N., Barve, M., Asai, Y., Tenkova-Heuser, T., Heuser, J. E., Uesugi, M., Aiba, K. and Nakatsuji, N.: Cell Rep., 2, 1448, (2012).

POLARIC™ 活细胞荧光变色溶剂

新型荧光染料

◆背景

　　POLARIC是活细胞独特的变色荧光溶剂。POLARIC可根据细胞器微环境的疏水性变化，发射光谱改变显著。

◆特点和优点

●　细胞毒性极低。
●　在460-520nm的激发波长可达到最小细胞损伤。
●　抗褪色荧光。
●　根据细胞器的微环境的疏水性/亲水性，发射光谱改变显著

◆实验流程

１．用3μL乙醇溶解红色染料沉淀，并将染料溶液转移到10mL培养基（染色溶液）中。 染色溶液可在4℃

       保存2周，避光保存。
２．将细胞培养在玻璃底皿（非液晶玻璃）上。
３．去除培养皿中的培养基，用PBS冲洗，加入等体积的预热染色溶液。

４．细胞在5％CO₂，在37℃条件下孵育2小时10分钟。 染色条件应针对细胞进行优化。

５．染色后用培养基洗涤细胞培养物3次。

６．使用荧光显微镜在Ex 460nm 520nm和Em 520nm 700nm下观察染色的细胞。

◆应用

1、使用案例<HEK293>
　　根据不同细胞器“着色变化”不同。

2、使用案例<Hela细胞>

3、使用案例<rVAC（大鼠内脏脂肪细胞）>
　　线粒体：橙色
　　细胞膜：绿色
　　内质网：黄色

4、使用案例<大鼠心肌细胞>
　　可使用不同的颜色染色心肌细胞（橙色）和非心肌细胞。染色后，心肌细胞继续跳动。

染色结果比较

5、使用案例<大鼠骨髓单核细胞>

　　在大鼠骨髓单核细胞-破骨细胞分化培养过程中，染色观察大鼠骨髓单核细胞向破骨细胞分化的过程。

体内释放的Anandamide可缓解疼痛

Anandamide (N-花生四烯酸氨基乙醇，AEA)是体内释放的一种大麻脂类衍生物，用于缓解疼痛。作为大麻类物质，主要结合并激活G蛋白偶联大麻素受体(CB)以及细胞膜内外其它受体。加州大学欧文分校Dr. Daniele Piomelli 及其同事报道了一种新的方法可提高anandamide 的作用效果(Fu et al (2011) Nat Neurosci. 15(1):64-9)。国际研究小组在脑细胞内识别出一种蛋白，命名为FAAH-like anandamide transporter (FLAT)，它主要将anandamide转移到细胞内固定位置，随后被脂肪酸酰胺水解酶(FAAH) 水解成乙醇胺、花生四烯酸。抑制转运蛋白功能后可增加anandamide的作用效果。科研人员希望这些化合物能够增强anandamide的作用效果，为新的止痛药的研发奠定基础，此类新药与常见的一些具有镇定或成瘾作用的药物不同，没有副作用。抑制 FLAT可能特别有助于控制一些损害中枢神经系统的特定疼痛，同时也可降低对尼古丁、可卡因、鸦片等药物的成瘾。

Enzo Life Sciences提供大量与endocannabinoid通路相关的配体和抑制剂等，以及 cannabinoid receptors (CB1, CB2, and GPR55)相关受体。