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特点：
● 即用型试剂盒、数据重现性好
● 配制试剂所需的时间大幅缩短
● 检测结果不易受pH, 溶剂等因素影响
规格性状
产品概述
近年来的研究发现，人体内的抗氧化能力的降低与各种疾病的产生息息相关，因此人们对于具有抗氧化能力的功能食品的需求越来越高。 根据日本高知大学岛村等人的文献报道 1)，使用稳定的自由基 DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)作为底物的抗氧化能力检测法是数据重现性最好的一种方法。本试剂盒依据岛村老师的检测方法，将DPPH法的过程进行了改良和标准化，解决了以往实验中孔间差较大、试剂配制过程繁冗等问题。
本试剂盒在日本高知大学农林海洋学部的岛村智子老师的指导下开发而成 。
1) T. Shimamura et al., Anal. Sci., 2014, 30, 717-721
操作时间大幅缩短
DPPH和Trolox在溶液状态下都不稳定，需要现配现用。特别是作为底物的DPPH，一般还需要检测吸光度来确定含量，因此操作的步骤和时间都十分冗长。本试剂盒已经将所需的试剂准备好并分成小份单独包装，检测前只需要溶解定容即可开始实验，大幅缩短了操作步骤和时间。(DPPH的溶解需要超声波振荡发生器)
检测原理
检测步骤
将试剂盒样品加至96孔板，培养30分钟后即可上机检测。
将试剂盒样品加至96孔板，培养30分钟后即可上机检测。
检测结果不受各因素影响
用DPPH法检测抗氧化能力的时候，溶液中的pH以及溶剂的浓度等因素会对检测结果产生影响。本试剂盒通过优化操作步骤、调整溶液添加顺序等方法最大程度抑制pH和溶剂浓度对检测结果的影响。
pH对检测结果的影响 样品溶剂对检测结果的影响
试剂盒内含的Assay Buffer可以保证检测反应在一定 样品量只占检测溶液体积的1/10(20 μl)，因此样品的
的pH下进行。 溶剂无论是水还是无水乙醇，都不影响最终检测结果。
IC50值的复孔差
如果只用样品的抗氧化能力IC50值来评价，比较容易出现检测结果的波动。用标准物质(Trolox)和样品同时检测，通过Trolox等价活性值(TEAC)来评价的话，可以得到重现性高的检测结果。
TEAC（ μg TE/μg）= Trolox IC50 （μg/ml）/ Sample IC50（ μg/ml）
检测例
不同检测机构之间的检测结果的差异
下面3个不同的检测机构，使用本试剂盒检测已知的抗氧化物：没食子酸、儿茶酸、桑色素。用比色皿通过分光光度计检测Trolox等价活性值(TEAC)，结果显示3个检测机构之间的检测结果基本上没有差异。
参考文献：T. Shimamura et al., NipponShokuhin Kagaku Kogaku Kaishi, 2007, 54, 482 – 487
分光光度计和酶标仪检测结果的一致性
按照上面的实验的同样的方法，改用酶标仪和96孔板进行检测并计算Trolox等价活性值(Trolox)，检测结果也高度一致。
参考文献
1、Enjuro Harunari, Chiaki Imada, Yasuhiro Igarashi, “Konamycins A and B and Rubromycins CA1 and CA2, Aromatic Polyketides from the Tunicate-Derived Streptomyces hyaluromycini MB-PO13T”, J. Nat. Prod., 2019, 82, (6), 1609-1615.
2、Hiroki Ishida, Naoki Yamasaki, Yuuki Otsuka, Daichi Mori, Tomoko Shimamura, Takuya Hasegawa, Shuhei Ogo, Tadaharu Ueda, “Electrochemical Antioxidant Capacity Measurement: A Downsized System and Its Application to Agricultural Crops”, Anal. Sci., 2021, doi:10.2116/analsci.21P217.
3、M. A. Maky and T. Zendo, “Generation and Characterization of Novel Bioactive Peptides from Fish and Beef Hydrolysates”, Appl. Sci., 2021, doi:10.3390/app112110452.
4、S. Kato, K. Kuwata, “Pro-/anti-oxidative properties of dopamine on membrane lipid peroxidation upon X-ray irradiation”, Radiat. Phys. Chem., 2021, doi:10.1016/j.radphyschem.2021.109518.
5、F. F. Sofian, N. Kikuchi, T. Koseki, Y. Kanno, S. Uesugi, Y. Shiono, “Antioxidant p-terphenyl compound, isolated from edible mushroom, Boletopsisleucomelas”, Biosci., Biotechnol., Biochem., 2022, doi:10.1093/bbb/zbab224.
6、S. Jin, S. Kim, D. S. Kim, D. Son and M. Shin, “Optically Anisotropic Topical Hemostatic Coacervate for Naked-Eye Identification of Blood Coagulation”, Adv. Funct. Mater., 2022, doi:10.1002/adfm.202110320.
7、Mohamed Abdelfattah Maky，Takeshi Zendo，“Identification of a Novel Bioactive Peptide Derived from Frozen Chicken Breast Hydrolysate and the Utilization of Hydrolysates as Biopreservatives“，Bioactive Peptides in Health and Disease【A special issue of Biology (ISSN 2079-7737).】，2023，doi.org/10.3390/biology12091218
FAQ
| Q：是否可以用涡旋振荡或者移液器吹打来溶解DPPH？ |
| A：由于DPPH较难溶解，无法用涡旋振荡或者移液器吹打完全溶解。溶解不充分是造成误差的原因，请务必用超声振荡完全溶解。 |
| Q：计算得到的IC50值的数据重现性不好，有哪些需要注意的地方？ |
| A：(1) 请确认DPPH Reagent在溶解时，管内是否有残留。
由于DPPH较难溶解，请务必使用超声振荡器充分溶解后再使用。特别需要注意管底部是否有残留。具体的判断方法请参照下图或操作说明书。
(2) 样品的稀释浓度间隔过大，或者抑制曲线已经达到饱和的情况下检测出来的IC50值，可能会有较大差距。因此，请务必做预实验，摸索最佳浓度范围。
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| Q：每个试剂盒可以检测多少个样品？ |
| A：<100 tests包装>
・每个试剂盒可以用于一块96孔板的检测 ・为了确保数据的准确性，建议至少设置3个复孔，下面按照复孔数为3计算可检测的样品数。 ・每个试剂盒的DPPH Reagent的量可以检测96孔板的100个孔。 (Blank 2和DPPH Reagent不需要添加，所以不计入孔数) 未知样品：可以检测1个样品 ・对于未知的检测样品，需要做预实验，每个试剂盒可以检测1个样品。 <预实验的孔数：确认最佳浓度范围> 样品： 8个点(8个不同的梯度浓度系列) × 3 (3个复孔) = 24 well Blank：1 (Blank 1) × 3 (3个复孔) = 3 well <计算IC50所需要的孔数> 样品： 8个点(8个不同的梯度浓度系列) × 3 (3个复孔) = 24 well Trolox：4个点(4个不同的梯度浓度稀释系列) × 3 (3个复孔) = 24 well Blank：1 (Blank 1) × 3 (3个复孔) = 3 well *不需要预实验时，可以多检测一个样品。 已知IC50值大致范围的样品：可以检测3个样品 ・对于已知大致IC50值范围的样品，每个试剂盒可以检测3个样品。 对于不知道IC50值大致范围的未知样品，请按照操作步骤做预实验。 <计算IC50所需要的孔数> 样品： 8个点(8个不同的梯度浓度系列) × 3 (3个复孔) × 3 (3个样品)= 72 well Trolox：4个点(4个不同的梯度浓度系列) × 3 (3个复孔) = 12 well Blank：1 ( Blank 1) (n=3) = 3 well
<500 tests包装> ・每个试剂盒可以用于5块96孔板的检测（DPPH Reagent和Trolox Standard各5管） ・以下是500 tests包装可检测的样品数，100 tests包装请参考上面。 每个500 tests包装的试剂盒可以检测 (Blank 2和DPPH Reagent不需要添加，所以不计入孔数) 未知样品：可以检测8个样品 ・对于未知的检测样品，需要做预实验，每个试剂盒可以检测8个样品。 <预实验的孔数：确认最佳浓度范围> 样品： 8个点(8个不同的梯度浓度系列) × 3 (3个复孔) × 8 (8个样品) = 192 well Blank：1 (Blank 1) × 3 (3个复孔) × 3 (3块板) = 9 well <计算IC50所需要的孔数> 样品： 8个点(8个不同的梯度浓度系列) × 3 (3个复孔) × 8 (8块板) = 192 well Trolox：4个点(4个不同的梯度浓度稀释系列) × 3 (3个复孔) × 5 (5块板) = 60 well Blank：1 (Blank 1) × 3 (3个复孔) × 3 (3块板) = 9 well |
| Q：如果从开始反应到检测的时间间隔比较长，是否会影响检测值？ |
| A：如果反应时间过长，可能会影响检测结果。为了得到重现性高的检测数据，请严格按照操作说明书的步骤(25℃，30 min，避光)后，立即进行检测。检测多个孔板的时候，请保证各孔板的上机检测前的时间相同。 |
| Q：食品样品如果进行样品的前处理？ |
| A：关于食品样品的前处理方法，有下列检测实例供参考。<茶叶>
1) 取5 g 茶叶样品，加入50 ml 100℃的超纯水。 2) 在100℃下持续搅拌10 min。 3）10分钟搅拌后，用纱布过滤，并用超纯水将样品溶液调整至55 g。 4）将样品溶液转移至离心管，23℃，4000×g离心10 min。 5）用过滤膜(孔径0.45 μm)过滤上清液，制成样品溶液。
<青椒、红椒> 1) 将样品冻结干燥后用搅拌机打成粉末。 2) 取0.5 g粉末状的样品，添加2.5 g海砂和5 ml MWA提取溶剂。 (MWA溶剂的配制方法为 无水乙醇：超纯水：醋酸 = 90：9.5：0.5) 3) 搅拌10 s后，在超声波浴中37℃超声振荡5 min。 4) 23℃，1600×g离心10 min，回收上清。 5) 向沉淀物中再次加入5 ml MWA，重复步骤3，步骤4的操作3次。 6) 将所有回收得到的上清液加入25 ml容量瓶，用MWA定容作为检测样品。 |
| Q：如果样品有混浊，是否可以检测？ |
| A：<对于有混浊的样品>
样品中的混浊会影响检测结果。 我们尝试过用以下溶剂检测样品：水、无水乙醇、甲醇、WMA、DMSO。 *MWA溶剂的配制方法为 无水乙醇：超纯水：醋酸 = 90：9.5：0.5 *DMSO可能会造成TEAC值偏高。 如果样品不能完全溶解，仍然有混浊时，请将样品过滤后再使用。 混浊部分的抗氧化能力无法检测。 如果溶剂是水，还可以用SOD Assay Kit-WST检测。 由于DPPH的检测原理与SOD试剂盒的原理不同，可以用双指标进行验证。 另外，含有大量胡萝卜素的样品或者溶液呈紫色的样品不适用本试剂盒检测。 推荐用其他方法检测。 |
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