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近年来研究发现，外泌体作为细胞外囊泡（Extracellular vesicle; EV）的一种，与癌症的恶化与转移密切相关， 外泌体相关的研究也逐渐成为了关注的热点。为了研究通过外泌体的细胞间通信，细胞摄入外泌体时的示踪技术非常重要，然而目前广泛使用的磷脂双分子层的荧光染料存在明显的缺点（1. 染色后外泌体粒径增大。2. 荧光染料自身形成粒子，造成背景增高）。本产品是为了解决这些问题而开发的新型荧光染料，并且有 Green, Red, Deep Red 三种颜色，可满足多重染色在内的各种实验需求。

更准确地观察外泌体的动态

常用于染色外泌体的膜染色染料(S公司 产品P)，染料本身会引起凝集，产生不来源于外泌体的荧光聚点，导致外泌体的性质变化和背景上升等问题¹⁾²⁾。

ExoSparkler系列中使用的染料(Mem Dye-Green，Red，Deep Red)不会引起荧光凝集，也几乎不影响外泌体的性质，因此可以更准确地观察外来体的动力学。

参考文献

1) Mehdi Dehghani et al.,“Exosome labeling by lipophilic dye PKH26 results in significant increase in vesicle size”.bioRxiv., 2019, doi:10.1101/532028.

2) Pužar Dominkuš P et al.,“PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles.”Biochim Biophys Acta Biomembr., 2018, doi: 10.1016/j.bbamem.2018.03.013.

特点1:荧光染料不会在细胞外聚集

将使用Mem Dye-Deep Red和使用产品P(绿色或红色)染色的外泌体添加到HeLa细胞中，并用荧光显微镜观察进入细胞内的外泌体。

结果，在用产品P(绿色或红色)染色的外泌体中，发现了疑似染料聚集的细胞外荧光亮点。

Mem Dye-Deep Red(紫)：Ex： 640 nm/ Em： 640-760 nm

S公司 P产品(绿)：Ex： 561 nm/ Em： 560-620 nm

S公司 P产品(红)：Ex： 640 nm/ Em： 650-700 nm

实验条件

通过超速离心法提取的外泌体(蛋白质量为10 µg)，使用不同荧光染料染色后，添加到HeLa细胞(1.25×10⁴cells)中，孵育24小时，观察清洗后的荧光图像。

通过NTA (Nanoparticle Tacking Analysis)技术检测发现，Dojindo的Mem Dye-Deep Red没有荧光聚集现象，而P产品（绿色或红色）发现了可疑的100-500 nm粒径的粒子。

*检测装置：LM10-HSBFT 14（Nanosight公司生产）

与Mem-Dye溶液相比，P产品溶液的粒径也发生变化

另外，Mem Dye-Green, Red和Mem Dye-Deep Red一样，也没有发现荧光聚集的现象。

特点2：对外泌体的性质几乎没有影响

比较使用Mem Dye-Deep Red和使用产品P（绿色或红色）染色前后的外泌体，通过测定NTA（纳米粒子跟踪分析）和zeta电位以确认外泌体的性质是否变化。

结果，确认使用产品P（绿色或红色）会因染色而引起的外泌体的变化。

而Mem-Dye系列（Green、Red、Deep Red）对外泌体的性质几乎没有影响。

对外泌体颗粒直径的影响

制备Mem-Dye系列(Green、Red、Deep Red)以及产品P(绿色、红色)的10 µmol/l DMSO溶液，对10 µg(蛋白质量)的外泌体进行染色后进行了NTA(纳米粒子跟踪分析)。

结果，用Mem-Dye系列染色的外泌体与未染色的外泌体，粒子数以及粒子直径几乎没有影响(下图左)，但在产品P染色前后，粒子数和粒子直径有明显的变化(下图右)。

＊检测装置：LM10-HSBFT 14 (Nanosight公司生产)

对外泌体膜电位的影响

制备Mem-Dye系列(Green、Red、Deep Red)以及产品P(绿色、红色)的10 µmol/l DMSO溶液，并对10 µg(蛋白质含量)的外泌体进行染色后测定Zeta电位。

结果证实，使用Mem-Dye系列染色与使用产品P染色比较，使用Mem-Dye引起的Zeta电位变化会小很多

＊检测装置：Zetasizer Nano ZSP(Malvern Panalytical公司生产)

参考文献

Takashi Shimomura et al., “New Lipophilic Fluorescent Dyes for Exosome Labeling: Monitoring of Cellular Uptake of Exosomes”.bioRxiv., 2020, doi:10.1101/2020.02.02.931295.

特点3：外泌体的标记和纯化一步到位

ExoSparkler系列已经对外泌体标记的最佳条件进行摸索并做成了操作手册，试剂盒内包含纯化所需的过滤管，可以简单快捷的进行外泌体的标记和纯化。

纯化方法(未反应染料的去除)的比较

ExoSparklar系列中用于除去未反应染料的过滤管，与以往使用的相同用途的凝胶过滤法相比，能够以更高的回收率纯化外泌体。

关于使用过滤管进行纯化的有效性，常见问题是：标记后的纯化操作时，过滤膜上有颜色残留，能否确定未反应的染料彻底分离了？详见Q&A。

特点4：多种颜色选择 

ExoSparkler系列包括膜 (Mem Dye)和蛋白质 (Protein Dye)荧光染色试剂，各三种颜色 (Green, Red, Deep Red)。

■实验条件

超速离心法纯化的外泌体(蛋白质的量为10 μg)经过各试剂染色后，与HeLa细胞(1.25×10⁴ cells)一起培养24 h，清洗后进行荧光观察。

■观察条件

Green: Ex： 488 nm / Em： 490-540 nm

Red: Ex： 561 nm / Em： 570-640 nm

Deep Red: Ex： 640 nm / Em： 640-760 nm

外泌体的定位随时间而变化

■实验条件

通过超速离心法纯化的外泌体（蛋白质量为10 µg）用Mem Dye-Deep Red（外泌体膜染色试剂）染色，并加入到用溶酶体染色试剂染色的HeLa细胞（1.25×10⁴细胞）中，在1小时和4小时后观察到荧光图像。

结果表明，随着时间的推移Mem Dye-Deep Red的荧光点(紫色)与溶酶体的定位(绿色)重叠(白色)，外泌体的定位随时间的变化而变化。

观察条件：

Mem Dye-Deep Red：Ex 640 nm / Em 640 – 760 nm

溶酶体染色试剂： Ex 488 nm / Em 490 – 540 nm

① Exosome + Buffer

② Only Buffer

Fluorescent images at 4 h incubation

Detection conditions

Green：Ex 488 nm / Em 490 – 540 nm

Red ：Ex 561 nm / Em 570 – 640 nm

Deep Red：Ex 640 nm / Em 640 – 760 nm

1) R.Kawata, S.Oda, Y. Koya, H.Kajiyama, T. Yokoi, “Macrophage-derived extracellular vesicles regulate concanavalin A-induced hepatitis by suppressing macrophage cytokine production”, Toxicology, 2020, https://doi.org/10.1016/j.tox.2020.152544.