日本同仁化学AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 细胞内吞作用的内化过程检测货号:A558- DOJINDO

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AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 细胞内吞作用的内化过程检测货号:A558
AcidSensor Labeling Kit – 细胞内吞作用的内化过程检测
AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay
商品信息
储存条件:0-5度保存,避光
运输条件:常温

特点:

 

● pH敏感型荧光标记染料

● 试剂盒包括所有试剂

● 详细的标记手册

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细胞内吞宣传资料

选择规格:
3 samples

期货

微环境酸性时发出荧光

AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 细胞内吞作用的内化过程检测货号:A558

AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 细胞内吞作用的内化过程检测货号:A558

产品概述
原理
与其他产品的比较
实验例1
实验例2
实验例3
常见问题Q&A

产品概述

 

本款试剂盒一套试剂盒就包含了全部所需材料,可以对目标物质的内吞作用进行可视化分析。

 

AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 细胞内吞作用的内化过程检测货号:A558

试剂盒中包含的NH2-反应性AcidSensor(荧光探针)具有分子内活性酯基,与含氨基的目标物质(蛋白质)混合后形成稳定的共价键。AcidSensor标记后可在633纳米处被激发,可满足同时与绿色或红色荧光进行多重染色。

AcidSensor标记后在中性条件下几乎没有荧光,而在细胞中受环境酸化影响后会发出荧光,并被内吞作用所吸收。

AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 细胞内吞作用的内化过程检测货号:A558

*注意:

・与内吞作用的检测染料ECGreen(产品代码:E296)不同,本试剂盒是对进入细胞的目标物质进行染色。

本试剂盒可以标记分子量超过50,000和含有活性氨基的样本。

・本试剂盒也会标记分子量在10,000以上的除标记样本以外的含氨基的共存物质,这些物质也会被标记和回收。请在使用前对样品溶液进行纯化。

原理

AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 细胞内吞作用的内化过程检测货号:A558

AcidSensor的反应原理与细胞内吞途径的示意图

AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 细胞内吞作用的内化过程检测货号:A558

与其他产品的比较

AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 细胞内吞作用的内化过程检测货号:A558

实验例1

THP-1 细胞对标记凋亡细胞的吞噬作用实验

AcidSensor 标记的物质会被细胞吸收,当它们到达溶酶体等酸性细胞器时,荧光会增强。利用这一特性,我们通过将 AcidSensor 标记的凋亡细胞与 Calcein 标记的 THP-1 巨噬细胞共培养来评估凋亡细胞的吞噬活性。 结果,通过流式细胞术观察到了钙蓝蛋白(绿色)/AcidSensor(深红色)双阳性细胞,表明 THP-1 巨噬细胞吞噬了凋亡细胞(图 1a)。此外,当细胞松弛素 D 抑制 THP-1 巨噬细胞的吞噬作用时,双阳性细胞的比例也会下降(图 1b 和 1c),这证实该检测系统能准确评估吞噬作用。

最近的一份报告显示,抑制线粒体功能会诱导培养的小胶质细胞(中枢神经系统中的常驻巨噬细胞)转向糖酵解并减少吞噬作用*。为了复制这一结果,我们使用线粒体抑制的 THP-1 巨噬细胞进行了吞噬试验。结果显示,短链氯化石蜡是线粒体氧化磷酸化的强效解偶联剂,它能降低 THP-1 巨噬细胞的线粒体膜电位(MT-1,红色)(图 2)并减少吞噬作用(图 3)。

AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 细胞内吞作用的内化过程检测货号:A558

AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 细胞内吞作用的内化过程检测货号:A558

AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 细胞内吞作用的内化过程检测货号:A558

使用产品:

①AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 【货号: A558】

② -Cellstain- Calcein-AM 【货号:C542】

③ MT-1 MitoMP Detection Kit 【货号:MT13】

实验步骤:

制备 AcidSensor 标记的凋亡细胞(检测前一天)

1. 向 NH2-Reactive AcidSensor 中加入 10 μl DMSO 并溶解。将 5 μl NH2-Reactive AcidSensor 溶液加入 5 ml HBSS,制成工作液(稀释 1000 倍)。

2. 用 HBSS 冲洗 Jurkat 细胞两次。

3. 将 Jurkat 细胞(5×107 个)转移到试管中,离心后去除上清液。

4. 将工作液加入到装有 Jurkat 细胞(5×107 个)的试管中并悬浮。

5. 5. 37°C 孵育 30 分钟,用 AcidSensor 进行标记。

6. 标记后,用 HBSS 冲洗细胞两次。

7. 将标记了 AcidSensor 的 Jurkat 细胞悬浮在含有 10%FBS、添加了 0.5 μM 石杉碱的 RPMI 培养基中。

8. 在培养箱(37°C,5% CO2)中隔夜培养 18 小时,诱导细胞凋亡。

使用 THP-1 巨噬细胞进行吞噬试验

1. 为了将 THP-1 细胞分化成巨噬细胞,将 THP-1 细胞以 1×106 个细胞/孔的数量播种到 6 孔板中,然后在培养箱中用 100 nM PMA 培养 3 天。

2. 2. 用 HBSS 冲洗 THP-1 巨噬细胞两次后,在孔中加入含 HBSS 溶液的 Calcein-AM(货号:C542,0.5 μg/ml)和 MT-1(货号:MT13,1000 倍稀释),在培养箱中培养 30 分钟。

3. 用培养液清洗两次。

4. 用 10 μM  Cytochalasin D培养 1 小时,或用 5 μM FCCP 培养 30 分钟。

5. 用培养液清洗两次后,将 AcidSensor 标记的凋亡细胞(3×106 个细胞/孔)加入到含有或不含细胞松驰素 D 或 FCCP 的孔中。细胞在培养箱中培养 4 小时。

6. 用 HBSS 冲洗两次。

7. 加入 500 μl Imaging 缓冲溶液(货号:MT13),用细胞刮板收集平板上的 THP-1 巨噬细胞。

8. 用流式细胞仪分析细胞悬浮液。

实验例2

使用AcidSensor标记的BSA和小鼠IgG被HeLa细胞吸收的情况

使用该试剂盒将标记的BSA或小鼠IgG加入HeLa细胞中,2小时后观察HeLa细胞的吸收情况。

结果,在HeLa细胞中检测到了AcidSensor的荧光,证实两种标记的物体都被内吞途径吸收了。

AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 细胞内吞作用的内化过程检测货号:A558

<检测条件>

仪器:共聚焦显微镜

Ex = 633 nm, Em = 650-700 nm

实验例3

与内体染料共染

标记的IgG的细胞摄取量随时间变化 

用本试剂盒的AcidSensor标记的小鼠IgG和Dojindo的内吞检测染料(货号E296, ECGreen -Endocytosis Detection)一同添加到HeLa细胞中。

染色后10分钟、20分钟和180分钟观察细胞,结果显示AcidSensor(深红色)和内体膜(绿色)在同一位置定位,表明小鼠IgG是通过内吞作用途径被细胞吸收的。

AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 细胞内吞作用的内化过程检测货号:A558

<检测条件>

绿:ECGreen

(Ex = 405 nm, Em= 500-550 nm)

紫:AcidSensor

(Ex = 633 nm, Em= 650-700 nm)

常见问题Q&A

Q1: 样品溶液中存在的物质是否会影响标记反应?
A1:

取决于存在的物质种类。

在确认溶液中含有哪些物质后,对样品进行相应的纯化。

样品中共存的带有氨基的化合物和分子量超过10,000的化合物会降低标记效率,并且由于其分子量高,不能被过滤管去除。即使是没有氨基的化合物,高分子量的杂质也会造成过滤器的堵塞,从而影响标记和纯化。请在使用前对样品进行纯化。

 

Q2:回收标记体所使用的WS buffer是否有细胞毒性?
A2: WS buffer中含有几乎不会对细胞产生毒性的稳定剂(表面活性剂)。如果无论如何还是介意表面活性剂,可以根据自身习惯来选择合适的缓冲液来回收标记体。
Q3:如果用含有血清的培养基回收标记体,是否会影响观察?
A3: 血清中的成分虽然不会对AcidSensor的性能产生影响,但是由于血清中的蛋白质也会通过内吞途径进入细胞,可能会与标记的蛋白质的摄取产生竞争。请您根据自身实验目的进行判断。
Q4:如何计算标记率?
A4: A用WS buffer 5倍稀释标记体,然后检测500 nm和280 nm处的吸光度,按照下列公式进行计算,得出标记率。

AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 细胞内吞作用的内化过程检测货号:A558

 

A500: 500 nm 的吸光度

A280: 280 nm 的吸光度

εprotein: 蛋白质的280 nm处的摩尔吸光系数

NH2-Reactive AcidSensor 在WS buffer中的 A500 的摩尔吸光系数为[48400]。

NH2-Reactive AcidSensor 在280nm和500nm的吸光度、280nm/500nm的比值为[0.16]。

Q5:每个蛋白质分子上会有多少个AcidSensors标记上?
A5:对于小鼠IgG,我们已经确认每个分子平均有三个AcidSensors被标记。

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