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特点：
● 对超氧化物的选择性高
● 独特的荧光特性(λex: 540 nm; λem: 670 nm)
产品概述
线粒体在生成ATP的同时会生成超氧化物。正常情况下，细胞的抗氧化酶等物质会保护细胞免受活性氧的伤害。但是，当线粒体功能异常时，活性氧过量积累会造成细胞的各种机能紊乱。因此在评价细胞氧化应激水平时，往往需要同时检测线粒体的膜电位和线粒体的活性氧。
与其他试剂的比较
对各种活性氧的反应选择性
mtSOXDeep Red相较于T公司的产品Red，在各种活性氧中，对超氧化物的选择性更高。
另外，与其他公司产品所不同的是，mtSOX Deep Red拥有独特的荧光特性(λex: 540 nm; λem: 670 nm)，可以同时进行线粒体膜电位检测试剂(JC-1 货号MT09; MT-1 货号MT13)的共染色实验。
实验例
线粒体超氧化物和线粒体膜电位的同时检测
用HBSS清洗HeLa细胞后，使用mtSOX和同仁化学研究所的线粒体膜电位检测试剂(JC-1 货号MT09或MT-1 货号MT13)进行共染色实验，同时观察线粒体ROS和线粒体膜电位。
结果显示，伴随着线粒体ROS的产生，线粒体膜电位也逐渐降低。
<使用JC-1的实验操作>
<检测条件>
JC-1:绿Ex=488 nm; Em= 490-520 nm; 红Ex=561 nm; Em= 560-600 nm
mtSOX:Ex=633 nm; Em= 640-700 nm
Scale bar: 10 μm
<检测条件>
JC-1:绿Ex=485 nm; Em= 535 nm; 红Ex=535 nm; Em= 595 nm
mtSOX:Ex=550 nm; Em= 675 nm
<使用MT-1的实验操作>
<检测条件>
MT-1: Ex=561 nm; Em= 560-600 nm
mtSOX:Ex=633 nm; Em= 640-700 nm
Scale bar: 10 μm
<检测条件>
MT-1: Ex=545 nm; Em= 600 nm;
mtSOX:Ex=550 nm; Em= 675 nm
细胞内Total ROS和线粒体超氧化物的同时检测
用HBSS清洗HeLa细胞后，使用mtSOX和同仁化学研究所的细胞内ROS检测试剂(ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA- 货号：R252)进行共染色实验，通过线粒体超氧化物诱导剂Antimycin或过氧化氢诱导后进行荧光观察。
结果显示，可以分别观察到细胞内ROS诱导后的荧光增强和线粒体的ROS诱导后的荧光增强。
<实验操作>
<Antimycin刺激的结果>
<检测条件>
细胞内ROS: Ex=488 nm; Em= 490-520 nm
mtSOX:Ex=633 nm; Em= 640-700 nm
Scale bar: 10 μm
衰老细胞线粒体超氧化物检测
提示：脂褐素内源性荧光最小化
脂褐素对细胞衰老研究的影响
众所周知，衰老细胞会积累被称为脂褐素的氧化损伤蛋白质，这些蛋白质不会被溶酶体降解。线粒体作为溶酶体中的不溶性物质，导致荧光观察过程中背景增加。在细胞衰老研究中，有必要尽量减少脂褐素或其他物质对内源性荧光的影响。
使用升级后的荧光探针
我们分别使用T公司的产品和Dojindo公司的mtSOX Deep Red-线粒体超氧化物检测用荧光染料，检测在增殖期（第2代）和衰老（第14代）TIG-1细胞（人胎肺来源的成纤维细胞）中观察到线粒体超氧化物。
结果显示：在T公司的产品（染色浓度：5 μmol/l）的情况下，除了在增殖细胞和衰老细胞中观察到线粒体荧光外，还观察到很强的荧光背景。从未染色细胞的图像中发现该背景荧光是内源性荧光。另一方面，当使用mtSOX Deep Red（染色浓度：1μmol/l）时，可以观察到线粒体超氧化物产生的荧光，而荧光背景的影响很小。在观察线粒体超氧化物时，重要的是比较灵敏度、波长和通道，然后用合适的荧光探针进行观察，以最大限度地减少内源性荧光的产生。
※mtSOX的最佳浓度因细胞而异。关于不同染色浓度下内源性荧光的不同影响的讨论，请参阅”常见问题Q＆A”：解答当我观察衰老细胞时，发现线粒体外的荧光，应该如何处理？。
＜实验数据＞
本实验数据，由东京都老年病学研究所Fujita Yasunori教授友情提供。
＜参考文献＞
Y. Fujita, M. Iketani, M. Ito and I. Ohsawa, “Temporal changes in mitochondrial function and reactive oxygen species generation during the development of replicative senescence in human fibroblasts”, Exp. Gerontol., 2022, 165, 111866.
常见问题Q&A
| Q1：mtSOX Deep Red的检测原理是什么？ |
| A1：mtSOX Deep Red被Superoxide特异性氧化后会发出荧光，同时它还可在线粒体处积累，因此可以检测线粒体Superoxide。伴随着Superoxide的增加，线粒体的膜电位消失的话，核小体和细胞质会被染料染色。 |
| Q2：每个试剂盒可以检测多少个样品？ |
| A2：可检测的样品数如下。・ 96-well plate: 1块。
・ ibidi 8-well plate: 6块。 ・ 35 mm dish: 5块。 |
| Q3：是否可以用培养基以外的溶液配制Working solution？ |
| A3：可以，可使用HBSS或PBS代替培养基。 |
| Q4：各检测仪器适用的滤光片？ |
| A4：荧光显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪均可检测。
・激光共聚焦显微镜 Ex/Em: 561/640-700 nm (无红色荧光染料共染时) Ex/Em: 633/640-700 nm (与红色荧光染料共染时)
・荧光显微镜 TxRed Filter
・荧光酶标仪 Ex/Em: 535–565/660–690 nm
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| Q5：是否可以刺激后再染色？ |
| A5：在线粒体膜电位正常的前提下是有可能的。本染料依赖线粒体膜电位在线粒体处积累，因此如果药物刺激造成线粒体膜电位降低的话，染料将无法在线粒体处积累，影响检测结果。因此推荐先染色再进行药物刺激。 |
| Q6：当我观察衰老细胞时，发现线粒体外的荧光，应该如何处理？ |
| A6：请检查以下两个实验参数
（1）检测条件 制备染色和未染色的细胞，并在内源性荧光最小化的条件下进行观察。 （2）染料浓度 mtSOX的最佳浓度取决于细胞等多因素；可考虑在1-10μmol/l的浓度范围下摸索。 （参考案例） TIG-1细胞（人胎肺来源的成纤维细胞，传14代）用1、10μmol/l浓度的mtSOX染色并观察。观察到1μmol/l的细胞具有较少的内源性荧光。
＜实验数据＞ 本实验数据，由东京都老年病学研究所Fujita Yasunori教授友情提供。 |
产品文献
1、D. Sun, S. Cui, H. Ma, P. Zhu, N. Li, X. Zhang, L. Zhang, L. Xuan, J. Li , “Salvianolate ameliorates renal tubular injury through the Keap1/Nrf2/ARE pathway in mouse kidney ischemia-reperfusion injury”, 2022, J. Ethnopharmacol., doi:10.1016/j.jep.2022.115331.
2、Y. Fujita, M. Iketani, M. Ito, I. Ohsawa, “Temporal changes in mitochondrial function and reactive oxygen species generation during the development of replicative senescence in human fibroblasts”, 2022, Exp. Gerontol., doi:10.1016/j.exger.2022.111866.
3、R. Inoe, T. Tsuno, Y. Togashi, T. Okuyama, A. Sato, K. Nishiyama, M. Kyohara, J. Li, S. Fukushima, T. Kin, D. Miyashita, Y. Shiba, Y. Atobe, H. Kiyonari, K. Bando, A. S. Shapiro, K. Funakoshi, R. N. Kulkarni, Y. Terauchi, and J. Shirakawa, “Uncoupling protein 2 and aldolase B impact insulin release by modulating mitochondrial function and Ca2+ release from the ER”, 2022, iScience, doi:10.1016/j.isci.2022.104603.
4、A. Patel, M. Simkulet, S. Maity, M. Venkatesan, A. Matzavinos, M. Madesh & B. R. Alevriadou, “The mitochondrial Ca2+ uniporter channel synergizes with fluid shear stress to induce mitochondrial Ca2+ oscillations”, 2022, Sci. Rep., doi:10.1038/s41598-022-25583-7.
5、Hao Gu, Yuhui Zhu, Jiawei Yang, Ruixue Jiang, Yuwei Deng, Anshuo Li, Yingjing Fang, Qianju Wu, Honghuan Tu, Haishuang Chang, Jin Wen, Xinquan Jiang,”Liver-Inspired Polyetherketoneketone Scaffolds Simulate Regenerative Signals and Mobilize Anti-Inflammatory Reserves to Reprogram Macrophage Metabolism for Boosted Osteoporotic Osseointegration.Advanced Science”，2023, Advanced Science, doi：10.1002/advs.202302136
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