オートファジー（オートリソソーム）の検出試薬 DALGreen – Autophagy Detection 同仁化学研究所

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オートファジー（オートリソソーム）の検出試薬 DALGreen - Autophagy Detection 同仁化学研究所DALGreen – Autophagy Detection

01 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬

DALGreen – Autophagy Detection

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オートファジー（オートリソソーム）の検出試薬

  • 製品コード
    D675　 DALGreen – Autophagy Detection
容　量 メーカー希望
小売価格		 富士フイルム
和光純薬
20 nmol ￥31,900 344-09191

オートファジー（オートリソソーム）の検出試薬 DALGreen - Autophagy Detection 同仁化学研究所 DALGreenの最適濃度の検討については、
よくある質問の「DALGreenの最適濃度の検討方法を教えてください」
をご覧ください。

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技術情報

原理

オートファジー（オートリソソーム）の検出試薬 DALGreen - Autophagy Detection 同仁化学研究所
オートファジー（オートリソソーム）の検出試薬 DALGreen - Autophagy Detection 同仁化学研究所 DAPGreen、DAPRedと同様にオートファゴソーム形成時に色素が膜に取り込まれます。その後、リソソームと融合し酸性環境になったときにDALGreenの蛍光が増大します。

技術や使用製品に関する補足

グルタミン代謝とオートファジー

グルタミナーゼの安定化を介してオートファジーとグルタミノリシスを促進するタンパク質に関する報告例を紹介！

その他、疾患と細胞内代謝指標との関連性をマップでわかりやすく紹介しています。

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参考文献

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文献No. 対象サンプル 装置 引用（リンク）
1) 細胞
（HeLa, MEF）		 蛍光顕微鏡 H. Iwashita, H. T. Sakurai, N. Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K. Sasamoto, K. Okuma, S. Shimizu, and Y. Ueno, "Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux.", FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567.
2) 細胞
（HeLa）		 蛍光顕微鏡 T. Sakata, A. Saito and H. Sugimoto, "In situ measurement of autophagy under nutrient starvation based on interfacial pH sensing.", Scientific Reports., 2018, 8, 8282.
3) 細胞
（HS-MM）		 蛍光顕微鏡 Y. Egawa, C. Saigo, Y. Kito, T. Moriki and T. Takeuchi, "Therapeutic potential of CPI-613 for targeting tumorous mitochondrial energy metabolism and inhibiting autophagy in clear cell sarcoma.", PLoS One., 2018, 13, (6), e0198940.
4) 細胞
（HaCaT)		 蛍光顕微鏡 S. Abe, S. Hirose, M. Nishitani, I. Yoshida, M. Tsukayama, A. Tsuji and K. Yuasa, "Citrus peel polymethoxyflavones, sudachitin and nobiletin, induce distinct cellular responses in human keratinocyte HaCaT cells.", Biosci. Biotechnol. Biochem. ., 2018, 82, (12), 1347.
5) 細胞
（KGN)		 蛍光顕微鏡 W. Yuping, M. Congshun, Z. Huihui, Z. Yuxia, C. Zhenguo and W. Liping, "Alleviation of endoplasmic reticulum stress protects against cisplatin-induced ovarian damage.", Reprod. Biol. Endocrinol., 2018,doi: 10.1186/s12958-018-0404-4.
6) 細胞
（BmN)		 蛍光顕微鏡 S. Xue, F. Mao, D. Hu, H. Yan, J. Lei, E. Obeng, Y. Zhou, Y. Quan, and W. Yu, "Acetylation of BmAtg8 inhibits starvation-induced autophagy initiation.", Mol. Cell Biochem., 2019,doi: 10.1007/s11010-019-03513-y.
7) 細胞
（HeLa)		 蛍光顕微鏡 F. Hongbao, Y. Shankun, C. Qixin, L. Chunyan, C. Yuqi, G. Shanshan, B. Yang, T. Zhiqi, L. Z. Amanda, T. Takanori, C.Yuncong, G. Zijian, H. Weijiang and D. Jiajie, "De Novo-Designed Near-Infrared Nanoaggregates for Super-Resolution Monitoring of Lysosomes in Cells, in Whole Organoids, and in Vivo.", ACS Nano, 2019, 13, (12), 1446.
8) 細胞
（RT-7)		 フローサイトメーター E. Sasabe, A. Tomomura, N. Kitamura and T. Yamamoto, "Metal nanoparticles-induced activation of NLRP3 inflammasome in human oral keratinocytes is a possible mechanism of oral lichenoid lesions.", Toxicol In Vitro., 2020, 62, 104663.
9) 細胞
（骨髄腫)		 蛍光顕微鏡 J. Xia, Y. He, B. Meng, S. Chen, J. Zhang, X. Wu, Y. Zhu, Y. Shen, X. Feng, Y. Guan, C. Kuang, J. Guo, Q. Lei, Y. Wu, G. An, G. Li, L. Qiu, F. Zhan and W. Zhou, "NEK2 induces autophagy-mediated bortezomib resistance by stabilizing Beclin-1 in multiple myeloma.", Mol Oncol, 2020, DOI: 10.1002/1878-0261.12641.
10) 細胞
（Human L2)		 蛍光顕微鏡 Q. Xu, W. Shi, P. Lv, W. Meng, G. Mao, C. Gong, Y. Chen, Y. Wei, X. He, J. Zhao, H. Han, M. Sun and K. Xiao, "Critical role of caveolin-1 in aflatoxin B1-induced hepatotoxicity via the regulation of oxidation and autophagy.", Cell Death Dis., 2020, 11(1), 6.
11) 細胞
（心筋)		 蛍光顕微鏡 L Cui, LP Zhao, JY Ye, L Yang, Y Huang, X.P. Jiang, Q. Zhang, JZ. Jia, DX. Zhang and Y. Huang, "The Lysosomal Membrane Protein Lamp2 Alleviates Lysosomal Cell Death by Promoting Autophagic Flux in Ischemic Cardiomyocytes.", Front Cell Dev Biol, 2020,DOI:10.3389/fcell.2020.00031.
12) 細胞
（IPEC-J2)		 蛍光顕微鏡 Y Yang, J Huang, J Li, H Yang and Y. Yin, "The Effects of Butyric Acid on the Differentiation, Proliferation, Apoptosis, and Autophagy of IPEC-J2 Cells..", Curr. Mol. Med., 2020, 20(4), 307.
13) 細胞 (線維芽細胞、腎臓上皮細胞) 蛍光顕微鏡 M. M. Ivanova, J. Dao, N. Kasaci, B. Adewale, J. Fikry and O. G. Alpan, "Rapid Clathrin-Mediated Uptake of Recombinant α-Gal-A to Lysosome Activates Autophagy", Biomolecules, 2020,  10(6), 837.
14)

細胞 (NHEKs)

 蛍光顕微鏡 S. Ikeoka and A. Kiso, "The Involvement of Mitophagy in the Prevention of UV-B-Induced Damage in Human Epidermal Keratinocytes ", J. Soc. Cosmet. Chem. Jpn., 2020,  54(3), 252.
15) 細胞
（HeLa）		 蛍光顕微鏡(超解像) Q. Chen, M. Hao, L. Wang, L. Li, Y. Chen, X. Shao, Z. Tian, R. A. Pfuetzner, Q. Zhong, A. T. Brunger, J. Guan and J. Diao, "Prefused lysosomes cluster on autophagosomes regulated by VAMP8", Cell Death Dis., 2021, doi:10.1038/s41419-021-04243-0.
16) 細胞
（SH-SY5Y）		 蛍光顕微鏡 Chang-ki Oh, Nima Dolatabadi, Piotr Cieplak, Maria T. Diaz-Meco, Jorge Moscat, John P. Nolan, Tomohiro Nakamura and Stuart A. Lipton, "S-Nitrosylation of p62 Inhibits Autophagic Flux to Promote α-Synuclein Secretion and Spread in Parkinson’s Disease and Lewy Body Dementia", J. Neurosci., 2022, doi:10.1523/JNEUROSCI.1508-21.2022.

よくある質問

Q

DALGreen working solutionは、どのくらい安定ですか？

A

保存できません。用時調製してください。

Q

DMSO stock solutionは、どのくらい安定ですか？

A

調製後は、-20℃で保存してください。調製後1ヶ月間安定です。
また使用量に応じて小分けし保存することをお勧めします。

Q

オートファジーに関連するタンパク質をノックダウンし評価した実績はありますか？

A

 オートファゴソーム膜形成に関与しているULK1及びULK2をノックダウンした細胞と野生株の細胞を飢餓誘導し、DALGreenにて評価した実績がございます。

評価では、ULK1/ULK2ノックダウン細胞に比べ、野生株ではDALGreenの蛍光が増大している結果が得られています。

本評価データは下記論文のSupporting Information（Fig. S5）をご参照ください。

なお、オートファジーのマーカーであるLC3-RFPとDALGreenを共染色し、殆どのPuncta（斑点）が共局在する結果も得られております。本実験データは、下記論文のFig..1をご参照ください。

H. Iwashita, H. T. Sakurai, N. Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K. Sasamoto, K. Okuma, S. Shimizu, and Y. Ueno, "Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux", FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567.
論文へのリンクは製品HPにございます。
製品HP：DALGreen – Autophagy Detection

Q

リソソーム染色試薬との違いはありますか？

A

リソソーム染色試薬は、細胞内のリソソームに局在します。一方、DALGreenはオートファゴソームに
局在した後、オートファゴソームとリソソームが融合した際に蛍光が増大します。

そのため、リソソーム染色試薬とDLGreenで共染色した場合、リソソーム染色試薬由来の蛍光のうち、オート

リソソームの部分がDALGreenの蛍光と重なります。

本評価データは下記論文のSupporting Information（Fig. S5）をご参照ください。

H. Iwashita, H. T. Sakurai, N. Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K. Sasamoto, K. Okuma, S. Shimizu, and Y. Ueno, "Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux", FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567.
論文へのリンクは製品HPにございます。
製品HP：DALGreen – Autophagy Detection

Q

推奨フィルターを教えてください。

A

励起フィルター：350～450 nm
蛍光フィルター：500～560 nm

なお、共焦点顕微鏡を用いて488 nm励起により蛍光観察した実績がございます。
弊社HP内の製品ページの実験例を参照ください。

Q

DALGreenの最適濃度の検討方法を教えてください。

A

試薬の特性により、試薬の濃度が高すぎたり低すぎたりすると、オートファジー誘導時と誘導していないコントロールとの差が判りにくい場合があります。
下記の情報を参考に試薬濃度の検討することをお勧めします。

細胞種によりDALGreenの最適濃度は異なります。
DALGreenを薄い濃度から(目安0.1 μmol/l）から数点段階的に振ってご検討ください。
(濃い濃度は4 μmol/L前後を目安としてください)

（参考）
小社では、HeLa, HepG2、CHO細胞にて、細胞種毎のDALGreenの最適濃度の検討を行いました。
DALGreenを下記濃度で染色し、アミノ酸不含培地にて培養してオートファジーを誘導しました。
その結果、下記の赤字の濃度条件ではコントロールとの誘導時との差が見られました。

細胞種 DALGreen 濃度
HeLa 4 µmol/l 2 µmol/l 1 µmol/l 0.5 µmol/l
HepG2 4 µmol/l 2 µmol/l 1 µmol/l 0.5 µmol/l
CHO 4 µmol/l 2 µmol/l 1 µmol/l 0.5 µmol/l

 

【HeLa細胞】
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【HepG2細胞】

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【CHO細胞】

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Q

タイムラプスイメージングを行う上で注意点はありますか？

A

測定条件設定のための予備実験を行ってください。
試薬の特性上、染色直後は初期蛍光値が高くなる傾向があるため、以下の手順を参考に予備実験およびタイムラプスイメージングを行ってください。

①予備実験
・コントロール細胞(オートファジーを誘導しない細胞)を用いる。
・取扱説明書に従い、Working soluitonで染色後、培養培地で2回洗浄する。
・通常培地を添加した後、蛍光の時間変化を観察する。
・下図の様に、染色後に細胞内の蛍光が次第に低下した後、蛍光の変化が安定してくる時間(図中 T)を確認する。
※条件は細胞の種類により変わる可能性があります。

（参考）
HeLa細胞の場合、染色後の約60分経過すると蛍光強度が安定することを確認しております（DALGreen）。

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②タイムラプスイメージング
・細胞を Working solutionで染色後、培養培地中で細胞を37℃でインキュベートする。
　※予備実験で設定した時間でインキュベートする。
　※染色後、直ぐにはオートファジー誘導は行わない。
・インキュベート後にオートファジーの誘導を開始して、タイムラプスイメージングをする。

（参考）
HeLa細胞をDALGreenで染色し、通常培地中で60分間(予備実験で設定した時間)培養後、オートファジーを誘導しました。

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Q

オートファジーにはどのような経路があり、DALGreenはどの状態を検出するのですか？

A

オートファジーには、Atg5依存的オートファジー(LC3が変化する)とLC3の変化を伴わない、Atg5非依存的オートファジーがあることが知られております*。

DALGreenはオートファゴソーム膜に取り込まれ、その後、リソソームと融合し酸性環境下で蛍光が増大します。

そのため、DALGreenはオートリソソームの状態を検出します。

*参考資料 :　新たなオートファジー機構の発見　清水重臣

▶初めて検出する細胞種や実験系の場合は、よくある問い合わせ【 DALGreenの最適濃度の検討手順】をご参照ください。

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取扱条件

規格
性状： 本品は淡黄色固体でメタノール及びジメチルスルホキシドに溶ける。
純度(HPLC)： 90.0％ 以上
取扱条件
保存条件: 冷凍,遮光 , 取扱条件: 窒素置換
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