DPPH Antioxidant Assay Kit

02 酸化ストレス関連試薬

DPPH Antioxidant Assay Kit

• 酸化ストレス関連試薬
• 食品機能評価

抗酸化能測定キット

• キット化したDPPH法で抗酸化能を再現よく検出
• 試薬の調製手間を大幅削減
• 再現性の高いデータを実現
• 従来の課題を解決

• 製品コード
  D678　 DPPH Antioxidant Assay Kit

• ご購入方法
• お問い合わせ

マニュアル

簡単な準備

DPPH およびTrolox は溶液状態で不安定なため用時調製が必要ですが、特に測定に影響を与えるDPPH は、吸光度による含量確認まで行う必要があり、試薬調製には長い時間を要していました。本キットでは測定に必要な試薬が小分けされており、測定前の簡単な準備で、直ぐに実験を開始できます。
(DPPH の溶解操作には超音波洗浄機が必要です)

Q

IC₅₀値がばらつくのですが、注意点はありますか？

A

 (1) DPPH Reagentのチューブに溶け残りがないかご確認ください。

DPPHは溶けづらいため超音波洗浄機をお使い頂き、溶け残りなないよう、注意深く溶解して頂く必要があります。
特にチューブ底の先端にDPPHが溶け残ることがありますので、取扱説明書に記載の通り数回エタノールをチューブに移し入れ、エタノールに着色がなくなったことを確認しご使用ください。

 

(2) サンプルの希釈間隔が広い場合や、阻害曲線が飽和しているポイント（下図）で測定した場合IC₅₀値が大きく変動することがあります。そのため、予備実験にて最適な濃度域を確認されることをお勧めします。

Q

ボルテックスやピペッティングでDPPHを溶解しても良いですか？

A

DPPHは溶解しにくいため、ボルテックスのみでの溶解やピペッティング操作での溶解はできません。
溶け残りがIC50のばらつきの原因となりますので、必ず超音波洗浄機をお使いください。

Q

測定可能なサンプル数について教えて下さい。

A

＜100 tests使用時＞
・本キットは96穴マイクロプレート1枚分を測定できる試薬となります。
・データ信頼性を確保するため、n=3での測定をお勧めしております。そのため、測定可能なサンプル数は、n:3で測定したことを想定し下記の通り算出しています。
・1キットあたりのDPPH Reagent量は100 well分になります。
　（Blank２はDPPH Reagentを使用しないため、下記内訳のwell数にはカウントしていません）

未知サンプルの場合： 1サンプル
・小社キットで測定実績がない場合、1キットで1サンプル分の測定が可能です。

＜予備実験時の使用ウェル数：最適濃度域の確認＞
サンプル：8（8点の希釈系列） X 3（n:3） = 24 well
Blank：1（Blank1） X 3（n:3） = 3 well

＜IC₅₀値の算出時の使用ウェル数＞
サンプル：8（8点の希釈系列） X 3（n:3） = 24 well
Trolox： 4（4点の希釈系列） X 3（n:3） = 12 well
Blank：1（Blank1） X 3（n:3） = 3 well
＊予備実験不要のサンプルの場合、もう１サンプル測定が可能。

IC50値が既知の場合： 3サンプル
・小社キットでIC50値を既に測定した実績のあるサンプルの場合、3サンプルの測定が可能です。
小社キットでIC50値を測定されていない場合は、未知サンプルとして予備実験をされることを推奨いたします。

＜IC₅₀値の算出時の使用ウェル数＞
サンプル：8（8点の希釈系列） X 3（n:3） X 3（サンプル数） = 72 well
Trolox： 4（4点の希釈系列） X 3（n:3） = 12 well
Blank：1（Blank1） X 3（n:3） = 3 welll

＜500 tests使用時＞
・本キットはDPPHが1プレート毎に測定できるように５本組みとなっております。
・下記内容は、500 testsをまとめて測定する場合の測定可能なサンプル数です。１プレート毎に測定する場合は、上記の100test使用時のサンプル数を参照ください。
・1キットあたりのDPPH Reagent量は500 well分になります。
　（Blank２はDPPH Reagentを使用しないため、下記内訳のwell数にはカウントしていません）

未知サンプルの場合： 8サンプル
・小社キットで測定実績がない場合、1キットで8サンプル分の測定が可能です。

＜予備実験時の使用ウェル数：最適濃度域の確認＞
サンプル：8（8点の希釈系列） X 3（n:3） X 8 (8サンプル)= 192 well
Blank：1（Blank1） X 3（n:3） X 3 (3 プレート) = 9 well

＜IC₅₀値の算出時の使用ウェル数＞
サンプル：8（8点の希釈系列） X 3（n:3） X 8 (8サンプル)= 192 welll
Trolox： 4（4点の希釈系列） X 3（n:3） X 5 (5 プレート) = 60 well
Blank：1（Blank1） X 3（n:3） X 3 (3 プレート) = 9 well
 

Q

反応から測定までの時間が長くなった場合、測定値に影響しますか？

A

反応時間が長くなると、測定値が変化する可能性があります。
再現精度のよい結果を得るためにも、取扱説明書に記載のインキュベーション（25℃、30分、暗所）後は速やかに測定ください。
複数のプレートを測定する場合、各プレート毎の測定までの時間を合わせてください。

Q

食品の前処理方法を教えて下さい。

A

前処理方法として下記の実施例があります。

 

<茶葉>

1) 茶葉試料 5 g に100℃ の超純水 50  ml を加える。

2) 100℃ で 10 分間攪拌して抽出する。

3) 10 分後、超純水を用いて 55 g に重量調整を行い、綿ろ過する。

4) 抽出液を遠心管に取り、23℃、4000×g で 10 分間遠心する。

5) 上清をメンブレンフィルター (pore si0ze 0.45μm) でろ過したろ液を測定試料とする。

 

<ピーマン・パプリカ>

1) 試料は凍結乾燥したものをミキサーで粉末状にする。

2) 粉末試料 0.5 g に海砂 2.5 g を加え、抽出溶媒MWAを 5 ml添加する。

 (MWA組成 メタノール：超純水：酢酸＝90：9.5：0.5 の比率で混合した溶液)

3) 10 秒間の攪拌後、超音波洗浄層を用いて37℃、5 分間の超音波処理をする。

4) 23℃、1600×g で 10 分間遠心し、上清を回収する。

5) 沈殿物に再度、MWAを5 ml 添加し、3)~4) の処理・回収を 3 回繰り返す。

6) 回収した上清をMWAを用いて25 mlに定容し、測定試料とする。

Q

サンプルに濁りがありますが測定できますか？ また、測定ができるかどうか確認方法はありますか？

A

<濁りのあるサンプルについて>

測定サンプルの濁りは測定に影響を与えます。

サンプルを溶解する実績のある溶媒は、水、エタノール、メタノール、MWA、DMSOです。

　※MWAの組成　メタノール：超純水：酢酸＝90：9.5：0.5 の比率で混合した溶液

　※DMSOではTEAC値が高くでる可能性があります

サンプルが完全に溶けきれず濁りがある場合には、ろ過を行ないサンプルを調製して下さい。

濁り成分が活性物質の場合、抗酸化活性は測定できません。

サンプルを溶解する溶媒が水の場合には、SOD Assay Kit-WSTでの使用も可能です。

DPPH法と反応機序が異なるため、2つの指標での測定をおすすめします。

また、カロテン類や濃く紫色に着色したサンプルでは測定が難しいため、

他の方法での測定をおすすめします。

 

<確認方法について>

本キットは測定前のウェルは、図のような組成になります。

測定前に濁りがあるかをチェックする方法として、

56%エタノール (水:エタノール=4:5) 180 µlにサンプル溶液 20 µl を加えた時に濁らないかをチェックして下さい。

濁る場合には、サンプルの濃度を薄くして、濁らない程度に調整して下さい。

特に、タンパク質を豊富に含む試料（例えば、牛乳など）はタンパク質の凝集を起こします。

この製品に関連する研究では、下記の関連製品も使われています。