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–Cellstain®– Calcein-AM solution
–Cellstain®– Calcein-AM solution
- 細胞染色用色素
- 細胞染色用色素
生細胞染色用色素
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製品コードC396 –Cellstain®– Calcein-AM solution
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CAS番号148504-34-1(Calcein-AM)
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化学名3′,6′-Di(O-acetyl)-4′,5′-bis[N,N-bis(carboxymethyl)aminomethyl]fluorescein, tetraacetoxymethyl ester, DMSO solution
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分子式・分子量C46H46N2O23=994.86
| 容 量 | メーカー希望 小売価格 |
富士フイルム 和光純薬 |
|---|---|---|
| 1 ml | ￥19,100 | 341-07901 |
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プロトコル
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パンフレット 細胞増殖測定 細胞染色プロトコル
参考文献
1) K. McGinnes, G. Chapman, R. Marks and R. Penny, "A Fluorescence NK Assay Using Flow Cytometry", J. Immunol. Methods, 1986, 86, 7.
2) S. J. Morris, "Real-time Multi-wavelength Fluorescence Imaging of Living Cells", BioTechniques, 1990, 8(3), 296.
3) S. A. Weston and C. R. Parish, "New Fluorescent Dyes for Lymphocyte Migration Studies Analysis by Flow Cytometry and Fluorescent Microscopy", J. Immunol. Methods, 1990, 133, 87.
4) D. M. Callewaert, G. Radcliff, R. Waite, J. Lefevre and D. Poulik, "Characterization of Effector-Target Conjugates for Cloned Human Natural Killer and Human Lymphokine Activated Killer Cells by Flow Cytometry", Cytometry, 1991, 12, 666.
5) Han-Qing Xie, R. Huang and V. W. Hu, "Intercellular Communication Through Gap Junctions Is Reduced in Senescent Cell", Biophys. J. , 1992, 62, 45.
6) S. A. Weston and C. R. Parish, "Calcein: a Novel Marker for Lymphocytes Which Enter Lymph Nodes", Cytometry, 1992, 13, 739.
7) X. M. Wang, P. I. Terasaki, G. W. Rankin Jr. , D. Chia, H. Pi. Zhong and S. Hardy, "A New Microcellular Cytotoxicity Test Based on Calcein AM Release", Hum. Immunol., 1993, 37, 264.
8) N. G. Papadopoulos, G. V. Z. Dedoussis, G. Spanakos, A. D. Gritzapis, C. N. Baxevanis and M. Papamichail, "An Improved Fluorescence Assay for the Determination of Lymphocyte-Mediated Cytotoxicity Using Flow Cytometry", J. Immunol. Methods, 1994, 177, 101.
9) L. S. D. Clerck, C. H. Bridts, A. M. Mertens, M. M. Moens and W. J. Stevens, "Use of Fluorescent Dyes in the Determination of Adherence of Human Leucocytes to Endothelial Cells and the Effects of Fluorochromes on Cellular Function", J. Immunol. Methods, 1994, 172, 115.
10) H. Ohata, Y. Ujiki and K. Momose, "Confocal Imaging Analysis of ATP-Induced Ca2+ Response in Individual Endothelial Cells of the Artery in Situ", Am. J. Physiol. , 1997, 272(6), 1980.
よくある質問
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Q
51Cr-release法との相関はありますか？
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A
下記文献にCalcein-AMと51Cr-release法との相関のデータが記載されております。
N.G.Papadopoulos, et.al., J.Immunol.Methods, 177,101-111(1994)
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Q
細胞染色色素の励起と蛍光の波長を教えて下さい。
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A
＊AOはフローサイトメトリーなどでは488nm励起で観察されることもあります
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Q
細胞染色試薬Cellstainの生細胞染色色素の中で細胞内に長く留まるのはどれですか？
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A
細胞内の保持という意味ではやはり「CFSE」が一番細胞の中に長くとどまることが出来ます。
蛍光強度は落ちますが、8週間細胞の中に蛍光色素があったのが確認されております。
「Calcein-AM」「BCECF-AM」で3日間蛍光が観察されております。
「Calcein-AM」は6時間で90％細胞内に保持されているとの報告もございます。
・S.A.Weston, et.al., J.Immunol.Methods, 133, 87-97(1990)
・H.P.Zhong, et.al., Hum.Immunol., 37, 264-270(1993)ただ、細胞障害活性ということでは「Calcein-AM」「BCECF-AM」の方が影響を及ぼさない
といわれております。
・L.S.D.Clerck, et.al., J.Immunol.Methods, 172, 115-124(1994)あと注意点としては、元々の基本骨格がFluoresceinなので、励起光による退光が
起りやすいので長時間の励起による蛍光観察は難しいかもしれません。
（退光防止剤などを使用すれば幾分よいかもしれませんが）
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Q
Calcein-AMの使用方法を教えてください。
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A
下記に一例としてHeLa細胞の場合を紹介します。
細胞の種類、観察条件に応じて試薬濃度の検討や固定を行って下さい。【試薬】
A液：-Cellstain®– Calcein-AM solution (1 mmol/L[1 mg/mL]溶液)
B液：A液をPBS(-)で500倍に希釈する(A液10 μLをPBS 5 mLで希釈すると2 μmol/Lとなる）
＊Calcein-AMは水溶液中で分解するので、B液は用時調製を行ってください。
【操作】
1)HeLa細胞をトリプシン-EDTAなどで回収し、細胞の懸濁液を準備する。
2)細胞懸濁液を遠心分離する(1,000 rpm,3 min)
3)上清を除き、PBS (-) を添加する(このとき細胞数が105～106 cells/mLになるように調製する）
4)ピペッティングなどで十分分散させる。
＊培養液中の血清などはバックグランドを上昇させる恐れがあるので、2)～4)の操作を
繰り返し行い、十分に洗浄する。
5)1.5 mLマイクロチューブに4)で得た細胞懸濁液30 μLを添加する。
6)これに[B液]を15 μL添加する。
7)マイクロチューブに蓋をして、37℃で15分間インキュベートする。
8)カバーガラス上に7)の液10 μLをのせ、上からカバーガラスを重ね、染色した細胞懸濁液を挟み込む
9)このカバーガラスを蛍光顕微鏡に置き、490 nmのフィルターで励起させ、黄緑色の蛍光を発する生細胞を観察する。
（フィルターについては490±10 nmのものであれば良好に観察することができる）
*血清やフェノールレッドはバックグラウンドとなるので除いておくこと。
*バックグランドが高い場合には、洗浄を行ってください。
*スライドガラス上に培養した細胞も同様に染色・観察が可能です。
*PIとの二重染色方法は、プロトコル「生細胞・死細胞を染め分けたい」をご覧下さい。
取扱条件
| 性状： | 本品は、無色液体である。 |
|---|---|
| 含量： | 試験適合 |
| 保存条件: 冷凍,遮光 | |
| 危険・有害 シンボルマーク |
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|---|---|
