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LunaScript® 反转录 SuperMix 预混液 收藏
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产品描述
特性
https://www.protocols.io/view/ncov-2019-sequencing-protocol-v3-locost-bp2l6n26rgqe/v3
概述
LunaScript 反转录 SuperMix 为优化的反转录预混液，可用于第一链 cDNA 合成、扩增子测序，以及两步法 RT-qPCR。该预混液含有具备热稳定特性的 Luna 反转录酶，可在更高温下合成 cDNA。试剂盒还提供小鼠 RNase 抑制剂，以保护模板 RNA 免受降解。LunaScript 反转录 SuperMix 预混液含有随机六聚体引物，Oligo-dT 引物，可均匀覆盖整个 RNA 靶标。此外，预混液还包含蓝色染料，可在两步法 RT-qPCR 起到示踪作用。样品起始量从高达 1 µg 到低至单拷贝 RNA，均能得到稳健、线性和灵敏的检测结果。
LunaScript 反转录预混液试剂盒（无引物） (NEB #E3025) 包含除引物外，第一链 cDNA 合成所需的所有组分，适用于 RT-PCR、RNA-seq 及其它应用。该预混液与随机引物、oligo dT 引物以及基因特异性引物兼容，让 cDNA 合成更灵活。更多信息请点击 https://www.neb.cn/products/e3025-lunascript-rt-master-mix-kit-primer-free
与 LunaScript 试剂盒版本 (NEB #E3010) 相比，该 LunaScript 预混液版本不含无核酶水和 No-RT 对照。更多信息如下：
图 1：LunaScript 产品比较
图 2：一步法和两步法 RT-qPCR 产品选择
图 3：LunaScript® SuperMix 反转录预混液在两步法 RT-qPCR 实验中展现了出色的灵敏度、线性关系和重复性
在 20 μl 反应体系中，使用 1 X LunaScript 反转录 SuperMix预混液，在标准反应条件下（25℃/2 分钟，55℃/10 分钟，95℃/1 分钟）将 RNA 反转录为 cDNA。然后使用 1 μl cDNA 作为模板和 Luna 通用 qPCR 预混液（NEB＃M3003）进行 qPCR 定量，每种浓度做三个重复。
A. 将梯度稀释的 Jurkat 总 RNA（1 μg–1 pg）反转录为 cDNA，然后对 β-actin 进行 qPCR 定量。
B. ERCC 对照（External RNA Controls Consortium）mix1 RNA 包含 50 – 5×109 拷贝的ERCC00130（10 fg–~10 ng），反转录为 cDNA 后进行 qPCR 进行定量。
图 4：LunaScript 反转录 SuperMix 预混液可覆盖长转录本
在标准反应条件（25℃/2 min、55℃/10 min、95℃/1 min）下，20 μl反应体系中，使用 1X LunaScript 反转录 SuperMix 预混液，将 Jurkat 总 RNA (1 μg – 1 ng) 反转录为 cDNA。取 1 μl cDNA 产物做为模板，使用 Luna 通用 qPCR 预混液 (NEB #M3003) 和覆盖 HERC1 整个 15.2 kb 转录本的 8 对引物，对 cDNA 覆盖度进行 qPCR 评估。结果显示：所有扩增靶标在每个上样浓度的重复实验中，均有良好扩增。
图 5：LunaScript 反转录 SuperMix 预混液对 RNA 靶标展现了出色的线性检测能力
使用市售的 cDNA 合成预混液，根据各厂商产品说明书，将 100 pg–1 μg 人（Jurkat）总 RNA 反转录为 cDNA。然后通过 8 个靶标（丰度、长度和 GC 含量不同）的 qPCR 结果对 cDNA 产物进行评估。使用 Luna 通用 qPCR 预混液（NEB＃M3003）或 Luna 通用探针法 qPCR 预混液（NEB＃M3004）进行 qPCR 检测。结果评估了扩增效率和 ΔCq，其中 ΔCq 衡量低起始量检测和缺乏无模板对照（NTC）扩增（ΔCq = NTC 的平均 Cq–最低起始量的平均 Cq）。绿色框表示目标扩增表现（效率 = 90-110％，ΔCq≥3）。
了解更多“Dots in Boxes”可视化荧光定量评价方法，请登陆：https://www.neb.cn/tools-and-resources/video-library/dots-in-boxes-visualization-of-qpcr-data
图 6：LunaScript 反转录 SuperMix 预混液的第一链 cDNA 合成时间最短，仅需 13 分钟。
比较了不同厂家的 cDNA 合成方案。LunaScript 反转录 SuperMix 预混液需要的反应时间最短，并可以耐受高温，避免了 RNA 复杂二级结构的影响。
图 7：LunaScript 反转录 SuperMix 预混液在室温条件下稳定性极佳
LunaScript 反转录 SuperMix 预混液与其它市售反转录产品在 25℃条件下放置 15 天，之后在说明书推荐反应条件下，以 100 pg–1 μg 人总 RNA (Jurkat) 为模板，反转录成为 cDNA。使用 Luna 通用 qPCR 预混液（NEB＃M3003）对 8 个不同丰度、长度和 GC 含量的靶标进行 qPCR 检测。结果评估了扩增效率和 ΔCq，其中 ΔCq 衡量低起始量检测和缺乏无模板对照（NTC）扩增（ΔCq = NTC 的平均 Cq – 最低起始量的平均 Cq）。绿色框表示目标扩增表现（效率 = 90-110％，ΔCq≥3）。