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| Guide-it™CRISPR/Cas9 Gesicle Production System |
· 细胞来源的纳米囊泡（Gesicle），可用于直接导入Cas9-sgRNA
· 转染效率低的哺乳动物细胞（分裂細胞、非分裂細胞、iPS細胞）也可实现有效的基因编辑
· Cas9蛋白质/sgRNA复合物可以快速从细胞内消除，降低脱靶效应
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| ■ 产品说明： |
Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Production System用于制备Cas9/sgRNA Gesicle，Cas9/sgRNA Gesicle是可以将Cas9蛋白质/sgRNA复合物导入到哺乳动物细胞的细胞来源的纳米囊泡（Gesicle）。与采用质粒或者病毒载体相比较，采用Cas9/sgRNA Gesicle进行基因编辑实验，可以实现在广泛细胞类型中高效导入Cas9蛋白质/sgRNA复合物，从而提高基因编辑效率。同时，可以严格控制用于细胞的Cas9蛋白质/sgRNA复合物的剂量和持续时间，从而降低脱靶效应。
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| ■ CRISPR／Cas9 Gesicle特点： |
· 适用于多种细胞类型
可在分裂细胞、非分裂细胞、原代细胞、细胞株、iPS细胞等多种细胞类型中进行基因编辑（图4）
· 高活性Cas9蛋白质／sgRNA确保有效的细胞导入
Cas9蛋白质／sgRNA直接导入细胞，无需转录和翻译过程，导入后可以直接开始基因编辑
· 实现在需要的时候进行基因编辑
可以严格控制Cas9蛋白质/sgRNA复合物的剂量和持续时间，与采用质粒或者病毒载体导入系统进行
基因编辑相比较，降低了脱靶效应
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| ■ CRISPR／Cas9 Gesicle原理： |
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图1． Cas9/sgRNA Gesicle制备和靶细胞导入
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(Step 1) 将诱导Gesicle形成的质粒预混液，靶特异sgRNA表达载体和Cas9表达载体共转染至Gesicle Producer 293T Cell Line (Code No. 632617)中。(Step 2) 利用Clontech iDimerize系统技术原理，借助与gesicle表面的膜结合红色荧光蛋白质CherryPicker之间的相互作用， iDimerize诱导配体将Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物载入到gesicle中。(Step 3) 携带红色荧光标记的Gesicle装配完成并从制备细胞中释放出来，收集培养基上清液，获得Cas9-sgRNA Gesicle浓缩储液。(Step 4) 收集获得的Gesicle适用于广泛细胞类型，可将靶细胞瞬时标记为红色并将Cas9-sgRNA复合物释放至靶细胞中。由于Cas9蛋白质C端有核定位信号（NLS），同时靶细胞培养液中没有dimerizer诱导配体，因此可以确保Cas9-sgRNA复合物与红色荧光蛋白质分离之后可以转运至细胞核内。
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| 图2．Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Production System实验流程 |
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| ■ 实验例 |
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| 图3. 脱靶效应比较 |
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比较采用Cas9-sgRNA Gesicle和质粒系统导入sgRNA所带来的脱靶效应。凝胶电泳结果、Guide-it™ Mutation Detection Kit检测结果以及测序结果均表明，采用Cas9-sgRNA Gesicle导入sgRNA时在潜在脱靶位点检测不到明显的脱靶效应，而采用质粒系统导入sgRNA时在靶基因位点EMX1和潜在脱靶位点均可检测到基因突变。
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| 图4. 不同细胞类型中基因敲除效率比较 |
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建立整合ZsGreen1表达框的不同细胞系，采用Cas9-sgRNA Gesicle（sgRNA以ZsGreen1为靶基因）处理细胞系，流式细胞仪进行结果分析。以添加不同量的ZsGreen1为靶基因的Cas9-sgRNA Gesicle（添加量分别为10 μl、20 μl、30 μl）处理组为实验组、以转染Cas9/sgRNA表达质粒处理组作为对照组，流式细胞仪检测基因敲除效率。
在Jurkat等难转染细胞类型中，Cas9-sgRNA Gesicle的Cas9-sgRNA导入效率和ZsGreen1基因敲除效率要优于Cas9/sgRNA表达质粒。 |
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| 图5.成功敲除hiPS细胞中的CD81基因 |
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以人CD81为靶标设计sgRNA，采用Gesicle Producer 293T Cell Line制备产生含有Cas9-sgRNA复合物的细胞纳米囊泡，收集Cas9-sgRNA Gesicle并将其添加至48孔板培养的未分化Cellartis human iPS cell line 18（Code No. Y00305）。Cellartis human iPS cell line 18以Cellartis DEF-CS Culture System（Code No. Y30010）为培养体系，培养6 hr和24 hr后更换为不含有Gesicle的DEF-CS培养基继续培养7天。未添加Gesicle处理并且采用相同培养条件培养的Cellartis human iPS cell line 18作为实验对照组。通过流式细胞仪检测经Gesicle处理和未经Gesicle处理的Cellartis human iPS cell line 18, 采用FITC标记的CD81抗体检测细胞表面CD81的表达情况。
Panel A. 未经处理的Cellartis human iPS cell line 18（左）和FITC标记的CD81抗体检测未经Gesicle处理的Cellartis human iPS cell line 18（右）。 Panel B. FITC标记的CD81抗体检测经Gesicle处理6 hr（左）和24 hr（右）的Cellartis human iPS cell line 18。
流式细胞仪检测结果表明， 经Cas9/sgRNA Gesicle处理6 hr 后，CD81基因敲除效率为43%；经Cas9/sgRNA Gesicle处理24 hr 后，CD81基因敲除效率为49%。 |
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| ■ 产品组份 |
| Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Production System（Code No. 632613） |
1. Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Packaging Set（ Code No. 632616）
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| Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Packaging Mix 1 (green cap) |
10 vials |
| Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Packaging Mix 2 (yellow cap) |
10 vials |
| A/C Heterodimerizer (500 nM in Ethanol) |
50 μl |
| Protamine Sulfate (4 mg/ml) |
200 μl |
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2. pGuide-it-sgRNA1 Vector System（ Code No. 632612）
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| a．pGuide-it-sgRNA1 Vector (Linear) (7.5 ng/μl) |
20 μl |
| b．Guide-it Ligation Components v2 |
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| DNA Ligation Mighty Mix |
50 μl |
| Guide-it Oligo Annealing Buffer |
1.5 ml |
| Guide-it Control Annealed Oligos v2 (100 fmol/μl) |
10 μl |
| Guide-it Sequencing Primer 1 (100 pmol/μl) |
10 μl |
| PCR-Grade Water |
1 ml |
| c．Stellar Competent Cells（ Code No. 636763） |
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| Stellar Competent Cells (100 μl/tube) |
10 tubes |
| SOC Medium (1 ml/tube) |
10 tubes |
| pUC19 Vector (0.1 ng/μl) |
10 μl |
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| Gesicle Producer 293T Cell Line（Code No. 632617） |
| Gesicle Producer 293T Cell Line |
1 ml |
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| ■ 保存 |
Stellar Competent Cells：－80℃
其它：－20℃
Gesicle Producer 293T Cell Line :液氮保存
· 收到产品后，立即将其保存在液氮中。
· 在液氮保存的情况下，立即复苏细胞进行细胞培养。
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| ■ 所需要的其它产品（主要产品） |
· 0.45 μm 无菌过滤器（cellulose acetate或者polysulfonate）
· 20 ml 无菌注射器
· 50 ml 离心管 (Corning Falcon Cat. No. 352017等)
· 离心机、摆动转子（50 ml 离心管可以满足8,000X g离心要求）（例如：离心机Beckman J2-HS、摆动转子 JS-7.5 swinging bucket rotor）
· 不含氯化钙和氯化镁的Dulbecco’s PBS（用于细胞培养）（Sigma Cat. No. D8537等)
· 细胞培养液
· 胶原蛋白质预包被培养板 |
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