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基于Protein A原理的快速免疫沉淀产品
Capturem IP & Co-IP Kit |
| IP和Co-IP是研究蛋白质与大分子（例如其他蛋白质）之间相互作用的很有意义的实验手段。Capturem IP & Co-IP Kit应用于IP和Co-IP实验，为快速提取独立蛋白质或提取蛋白质-蛋白质复合物提供了完整、易用性的解决方案。它是一款基于新型膜技术的高性能“抗体-蛋白质”复合物纯化试剂盒，其中包含实验必备试剂，同时也提供结合、洗涤和洗脱buffer。实验从样品上样至洗脱完成仅需5min。 |
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| ■ 产品特点 |
· 简单和快速的实验流程：抗体与样品孵育，之后在室温下进行的纯化仅需5 min
· 完整的解决方案：kit中包含用于IP和Co-IP实验的Capturem Protein A纯化柱和buffer，
且均经过优化
· 高浓度：洗脱液体积小，产物浓度高
· 高质量：样品在膜上停留时间短，避免复合物的凝集、解体或失活
· 通用性强：兼容宽泛的IP buffer和实验条件
· 一次性使用：基于新型膜技术的一次性离心柱，能避免污染 |
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| ■ 实验原理 |
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| Capturem Protein A 技术. 每个Capturem Protein A 纯化柱都含有高性能的改造过的Protein A 膜，表面积更大，与普通树脂相比，单位ml介质对抗体的结合能力更强。 |
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| ■ 快速纯化流程 |
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| 每个柱子最多可加入800 μl包含抗原抗体复合物的样品，然后用100 μl wash buffer洗涤， 30-50 μl elution buffer洗脱。每个步骤之间仅需1,000×g离心1 min，整个操作可在15min内完成。 |
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| ■ 与主流竞争产品提取流程对比 |
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| 与主流竞争产品相比，使用Capturem IP & Co-IP Kit能够显著缩短操作时间。 |
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| ■ 实验例 |
| 实验例1 |
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与在本实验中，将NIH3T3细胞裂解液与1 μg蛋白磷酸酶2A (PP2A) B亚基抗体进行孵育，然后上样至Capturem Protein A纯化柱。用300 μl洗涤buffer洗涤后用100 μl洗脱buffer洗脱，通过凝胶电泳分离各组分，再转移到PVDF膜上，用抗PP2A B抗体探测。结果显示在洗脱液中获得了很强的PP2A B蛋白质检测信号 (52 kDa)。
注：本实验例所使用的buffer与Capturem IP & Co-IP Kit中提供的buffer不同 (参见“实验方法：使用Capturem Protein A 纯化柱进行免疫沉淀实验”)。 |
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| 实验方法：使用Capturem Protein A 纯化柱进行免疫沉淀实验 |
将1 μg的PP2A B亚基兔多抗与NIH3T3细胞裂解液在室温下孵育10 min，同时不断颠倒混合。使用400 μl的平衡/上样 buffer（1.0 M glycine, 2 M NaCl, pH9.0）对Capturem Protein A纯化柱进行平衡，1,000×g离心1 min。将抗体-裂解复合物用裂解buffer稀释至400 μl然后上样，30×g离心4 min，再用100 μl的wash buffer (PBS) 洗涤，1,000×g 离心1 min。最后使用100 μl的elution buffer (0.1 M glycine, pH2.5)进行洗脱，收集管中预先装有10 μl的中和buffer (1 M tris，pH8.5)，1,000×g离心1 min。对各组分进行凝胶电泳分离，转移到PVDF膜上，使用anti-PP2A B兔源多克隆抗体 (Cell Signaling) 进行检测。
注：实验中使用的buffer是Capturem IP & Co-IP kit中优化buffer的早期配方。 |
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| 实验例2 |
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Capturem Protein A 产品具有出色的灵活性，能兼容广泛的实验条件，可以与其他试剂盒中的IP buffer搭配使用。为了测试该性能，将NIH3T3细胞裂解液（100 μl，含有130 μg总蛋白）与0.6 μg蛋白磷酸酶2A (PP2A) B亚基抗体分别在IP kit A，IP kit B或独立的裂解Buffer C中于4℃孵育1小时，总体积为400 μl。然后分别上样至使用对应IP buffer平衡过的Capturem Protein A纯化柱，最终使用30 μl of elution buffer洗脱一次（上图. Capturem Protein A columns A1，B1，C1），为了确保充分回收抗体复合物，重复洗脱一次（上图. Capturem Protein A columns A2，B2，C2）。同时进行的还有完全使用IP kit A和IP kit B的平行实验，按照各自的实验说明进行操作（上图. IP Kit A，IP Kit B），上样量及抗体用量与Capturem组相同。
结果显示，在原始样品（OS）中存在的组分，通过免疫沉淀操作被显著的富集了。Capturem Protein A纯化柱的结果显示，在第一次洗脱时，无论使用何种IP缓冲液，PP2A B蛋白信号都很强，用低pH甘氨酸洗脱缓冲液（A1，C1）的洗脱水平最高。
注：本实验例所使用的buffer与Capturem IP & Co-IP Kit中提供的buffer不同（参见“实验方法：使用Capturem Protein A 纯化柱进行免疫沉淀实验”）。
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| 实验方法：测定Capturem Protein A纯化柱与不同buffer的兼容性 |
将NIH3T3细胞裂解液（100 μl，含有130 μg 总蛋白质）与0.6 μg的PP2A B亚基抗体在Active Motif (A) 或Thermo Fisher Scientific (B) IP试剂盒中提供的IP buffer或者是Promega 的裂解buffer (C)中进行孵育，总体积为400 μl，于4℃孵育1 h，然后上样至使用100 μl 对应IP buffer平衡过的Capturem Protein A纯化柱，1,000×g离心1 min，100 μl wash buffer洗涤，1,000×g离心1 min，然后使用30 μl的低pH buffer（0.1 M glycine，pH2.5，A和C）或Thermo Fisher Scientific的低pH elution buffer（B）于1,000×g的条件下离心洗脱，再重复洗脱一次，以确保完全洗脱抗体复合物。与此同时，我们也分别使用Active Motif 和Thermo Fisher Scientific 的IP 试剂盒按照说明书的操作步骤单独进行了实验，起始的裂解液和抗体量与使用Capturem纯化柱相同。所有洗脱产物电泳分离后转移到PVDF膜上，使用PP2A B亚基的抗体（Cell Signaling）进行检测。
注：实验中使用的buffer是Capturem IP & Co-IP kit中优化buffer的早期配方。 |
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| 实验例3 |
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| p53是一个大小为53 kDa的核磷蛋白，具有抑制肿瘤的作用，并且在DNA损伤后参与抑制细胞增殖。已知野生型p53 能与几种病毒癌基因例如SV40 T 抗原 (SV40 T) 形成特异性复合物。使用293T细胞同时表达p53和SV40 T，我们证明了使用Capturem Protein A纯化柱能在基础水平免疫共沉淀p53和SV40 T。将Anti-SV40 T抗体加入到细胞裂解液中，室温下孵育混合物20 min，并不断颠倒混合。使用Capturem IP & Co-IP Kit中的优化buffer进行IP实验，洗脱产物经电泳分离并转移至PVDF膜。然后使用p53和SV40 T的小鼠单抗进行免疫印迹检测，Capturem Protein A 对SV40 T的IP结果显示对SV40 T进行的免疫沉淀实验在洗脱产物中同时检测到了SV40 T (97 kDa) 和p53 (53 kDa)的条带，证实了二者之间较强的相互作用（上图，E-SV40 T-1和E-SV40 T-2）。
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| 实验方法：从293T细胞中免疫共沉淀p53和SV40 T抗原 |
以同时表达p53 和SV40 T的293T细胞为样本制备细胞裂解液。向100 μg的293T细胞裂解液中加入
1 μg的SV40T抗体 (兔多抗, V-300, SCBT)，室温下孵育20 min，同时不断颠倒混合。负对照组，裂解液在不加SV40 T抗体的情况下孵育，然后使用完整的Capturem IP & Co-IP Kit一式两份进行IP实验。洗脱产物电泳分离后转PVDF膜，先用SV40 T的小鼠单抗(SCBT)进行检测，剥离后再用p53的小鼠单抗进行检测(SCBT)。 |
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| ■ 应用 |
· 免疫沉淀
· 免疫共沉淀
· 蛋白质复合物研究
· 抗体工程研究中筛选抗原 |
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