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| ■ 制品内容 (30 次量) |
| Random Primer (9 mer) |
60 μl |
| 10 × Buffer |
75 μl |
| dNTP Mixture (dGTP,dATP,dTTP各0.2 mM) |
75 μl |
| Exo-free Klenow Fragment (2 U/μl) |
30 μl |
| Control DNA solution (λ-Hind III digest 25 ng/μl) |
10 μl |
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| ■ 制品说明 |
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| 本试剂盒利用 [α–32P]或[3H]dCTP标记DNA，制备具有高比活性的杂交用DNA探针。本试剂盒的设计以Feinberg和Vogelstein法为基础加以了改进，利用9个碱基的随机寡聚核苷酸引物以及E. coli DNA Polymerase I 的 Exonuclease-free Klenow Fragment (无3′ →5′ 外切酶活性) ，在短时间内 (2-3分钟)即能得到比活性为1×109 dpm/μg的探针。它克服了表1中切口平移法的许多缺点。 |
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| ■ 原 理 |
| 利用杂交法检定具有特异序列的DNA时，必须使用高比放射活性的DNA探针。Feinberg和Vogelstein发表的随机引物标记法从少量DNA (10-20 ng) 制得的探针具有很高的比活性，并且可以直接在低熔点琼脂糖凝胶中标记DNA片段。原理如图1所示。首先通过热变性使模板DNA变为单链DNA，然后使随机引物与单链DNA退火，再利用Klenow Fragment合成互补链形成标记和未标记的核苷酸。 |
| 表1 |
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切口平移法 |
随机引物法 |
| 反应时间 |
延长反应时间会降低标记效率。 |
短时间内即可得到高比活性的探针。即使反应时间延长也不受影响。 |
| 探针比活性 |
～108 dpm/μg |
～109 dpm/μg |
| 模板纯度 |
琼脂糖等抑制反应 |
琼脂糖对反应没有影响 |
| 反应后纯化 |
需要除去未反应的dNTP |
不需要除去未反应的dNTP |
| 模板量要求 |
≥1 μg |
≥25 ng |
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| 以上对比数据的依据：以50 μCi的[α-32P]dCTP(370 MBq/ml)标记λ DNA-Hind III，以此为模板进行多重对照实验。 |
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| 图1 Random Primer Labeling原理 |
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