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| ■ 制品内容 (20 次量) |
| Mighty TA-cloning Kit |
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| pMD20-T vector (50 ng/μl) |
20 μl |
| Ligation Mighty Mix*1 |
50 μl × 2 |
| Positive Control Insert*2 |
10 μl |
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| A-overhang mixture |
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| A-overhang enzyme |
10 μl |
| 10 × Buffer |
20 μl |
| dATP |
10 μl |
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*1: Ligation Mighty Mix与DNA Ligation Kit (Code No.: 6023) 是同一种试剂。
*2: 3’端带有A碱基约200 bp DNA片段。 (以E.coli基因组DNA为模板，使用TaKaRa Ex Taq进行PCR反应得到的扩增产物。)(10 ng/μl) |
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| ■ 制品说明 |
使用Taq DNA聚合酶进行PCR反应，扩增获得的PCR产物3’端附有一个“A” 碱基。利用3’端附有“A” 碱基的PCR产物进行克隆时，与含有3’-T末端的载体通过T-A碱基互补配对原则进行克隆，此种方法被称为T-A克隆。Mighty TA-cloning Kit (Code No.: 6028) 是在短时间内快速地将PCR产物进行 T-A克隆的试剂盒。连接反应使用DNA Ligation Kit，操作简便，可在短时间内高效地进行连接反应。但使用PrimeSTAR系列的α型DNA聚合酶进行PCR反应时，因酶本身具有很强的3’→5’Exonuclease活性，扩增产物几乎都为平滑末端，不能直接进行TA克隆。PrimeSTAR系列DNA聚合酶的PCR产物进行TA克隆时，3’端必须添加“A”碱基。
本试剂盒中含有 (A-overhang mixture)，可简单地对PrimeSTAR系列DNA聚合酶的PCR产物3’端添加“A”碱基。A-overhang mixture与MightyTA-cloning Kit 配套使用，是PrimeSTAR系列DNA聚合酶PCR扩增产物的TA克隆专用试剂。
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| ■ 保存 |
| -20℃。 |
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| ■ 注意事项 |
1. Ligation Mighty Mix在冰上融解，轻轻混合后再使用。
2. 克隆时，根据插入片段的长度和方向，有时即使插入了DNA片段也会有不出现终止密码或读码框不改变的情况发生，在蓝白选择培养基上会形成淡蓝色菌落。出现这种现象时，建议进行菌落PCR确认插入片段。
3. 进行切胶回收纯化DNA片段时要避免UV照射时间过长。长时间照射，DNA会受到损伤，影响克隆效率。
4. 当PCR扩增用质粒模板与克隆载体 (pMD20-T vector；具有Ampr）有同样的选择标记基因时，为防止出现质粒模板自身的转化菌落，建议切胶回收扩增片段后再进行克隆。 |
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