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| ■ 制品内容 (10 次量) |
| AP1 Primer (100 pmol/μl ) |
30 μl |
| AP2 Primer (100 pmol/μl ) |
30 μl |
| AP3 Primer (100 pmol/μl ) |
30 μl |
| AP4 Primer (100 pmol/μl ) |
50 μl |
| Control Template (100 ng/μl )*1 |
10 μl |
| Control Specific Primer SP1 (10 pmol/μl )*2 |
10 μl |
| Control Specific Primer SP2 (10 pmol/μl )*2 |
10 μl |
| Control Specific Primer SP3 (10 pmol/μl )*2 |
10 μl |
| TaKaRa LA Taq (5 U/μl ) |
25 μl |
| 10 × LA PCR Buffer II (Mg2+plus) |
1 ml |
| dNTP Mixture (2.5 mM each) |
400 μl |
| 6 × Loading Buffer |
1 ml |
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*1 Control Template 是Human HL60来源的基因组DNA。
*2 Control Specific Primers是根据人基因组中的ALDOA基因设计的特异性引物。 |
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| ■ 制品说明 |
染色体步移技术 (Genome Walking) 是一种重要的分子生物学研究技术，使用这种技术可以有效获取与已知序列相邻的未知序列。染色体步移技术主要有以下几方面的应用：
1. 根据已知的基因或分子标记连续步移，获取人、动物和植物的重要调控基因，可以用于研究结构基因的表达调控。如分离克隆启动子并对其功能进行研究；
2. 步查获取新物种中基因的非保守区域，从而获得完整的基因序列；
3. 鉴定T-DNA或转座子的插入位点，鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导致的外源基因的插入位点等；
4. 用于染色体测序工作中的空隙填补，获得完整的基因组序列；
5. 用于人工染色体PAC、YAC和BAC的片段搭接。
对于基因组测序已经完成的少数物种 (如人、小鼠、线虫、水稻、拟南芥等) 来说，可以轻松地从数据库中找到某物种已知序列的侧翼序列。但是，对于大多数生物而言，在不了解它们的基因组序列以前，想要知道一个已知区域两侧的DNA序列，只能采用染色体步移技术。
以PCR技术为基础的染色体步移的主要问题是在预先不了解未知区域序列信息的情况下，如何设计两个特异性引物来扩增未知区域。而传统的染色体步移方法，如：反向PCR法、连接接头法等，都有操作复杂、非特异性扩增、连接效率低等弊端。
本试剂盒是一种根据已知基因组DNA序列，高效获取侧翼未知序列的试剂盒。本试剂盒是在TAIL-PCR (thermal asymmetric interlaced PCR，即交错热不对称PCR）的基础上进行改进的。相对于其它传统方法，本试剂盒具有高效、简便、特异性高、灵敏度高、一次性获得的未知序列较长等特点。其主要原理是根据已知DNA序列，分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物(SP Primer)，与试剂盒中提供的四种经过特别设计的退火温度较低的兼并引物，即AP1、AP2、AP3、AP4进行热不对称PCR反应。通常情况下，其中至少有一种兼并引物可以与特异性引物之间利用退火温度的差异进行热不对称PCR反应，通过三次巢式PCR反应即可获取已知序列的侧翼序列。如果一次实验获取的长度不能满足实验要求时，还可以根据第一次步移获取的序列信息，继续进行侧翼序列获取。此外，本试剂盒中还含有Control DNA及Control Primer，可以方便进行Control实验。 |
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| ■ 试剂盒原理：以使用兼并引物AP1为例。 |
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| 图1. Genome Walking Kit的实验原理图 |
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| ■ 各种引物的序列 |
| 引物名称 |
引物序列 (5’→3’) |
| Control Specific Primer SP1 |
AAATGCTGCAGCCTCCCTCTCACCC |
| Control Specific Primer SP2 |
AATACCAGAAATGTGCCCTCCCGTG |
| Control Specific Primer SP3 |
TGAGCTGGCAGGTTGTAGTCTCTGT |
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| ■ 特异性引物的设计 |
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| 图2. Genome Walking Kit特异性引物设计示意图 |
特异性引物设计原则：
根据经过验证的已知序列区 (最好不少于500 bp) 设计三个特异性引物 (见上图)：设计方向为需要扩增的未知区域方向，SP2的位置应设计在SP1的内侧，SP3位于SP2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，一般以60-100 bp为宜。引物设计原则：引物的长度为22-26 nt，GC含量45-55%，Tm值60-70℃，引物Tm值计算公式：Tm=69.3+0.41(G/C)%×100 – 650/L (引物碱基数)。其他要求和普通PCR反应用引物相同。 |
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| ■ 注意事项 |
1. 使用本试剂盒时，进行三次PCR反应时使用的AP引物必须是同种AP引物，即：1st PCR反应时使用的是AP1，则2nd和3rd PCR反应都必须使用AP1。对于不同物种，各条AP引物的扩增效率各不相同。
2. 在设计特异性引物时，SP3 Primer不要距离未知序列区域太远，一般以100-200 bp为宜，以增加获取未知序列的有效长度。 |
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