· 灵敏性更高：基于RACE技术保证低丰度TCR变体的检出
· 特异性更强：获得全长reads，目的reads占比高，更正确的配对信息
· 5’端捕获测序差异表达分析：通过比对5’末端信息，产生所有转录本差异表达数据
· 灵活、高通量的单细胞分析：单次实验同时分析8个样品，生成上千单细胞的测序数据
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| ■ 应用领域 |
· 人单细胞TCR库分析（TCRα和TCRβ克隆型）
· 5’端差异表达分析
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| ■ 产品说明 |
Takara Bio高通量TCR免疫组库解决方案应用SMART技术(Switching Mechanism at 5’End of RNA Template)和基于5’RACE的方法，用于捕获由ICELL8 cx Single-Cell System（Code No. 640188）分选得到的上千“活的单细胞”的TCR转录本完整V(D)J可变区域。产生的文库可同时提供α链和β链的多样性信息。
实验流程中，cDNA扩增阶段整合了Illumina特异的接头序列，产生的文库带有index接头，可直接用于Illumina平台测序。Takara Bio高通量TCR免疫组库解决方案也可以同时支持5’末端差异表达分析。
在ICELL8 cx单细胞分选系统上，与单个T细胞一起被分注到TCR芯片（Code No. 640200）上的还有阳性对照和阴性对照。每个TCR芯片含有5,184个纳升级微孔，预制了1,728种Barcode，每个Barcode在芯片上被预制3次。使用CellSelect软件鉴定出具有“活的单细胞”微孔后，SMART RT-PCR试剂将被分注到含“活单细胞”的微孔中，用于后续分析。连接了Barcode序列的cDNA继续在微孔芯片上完成PCR扩增。接下来，从芯片中将连接好Barcode序列的扩增产物集中收集，并进行纯化。纯化后的cDNA作为第一轮TCR特异性PCR的模板，而第一轮TCR特异性PCR的产物作为第二轮TCR特异性PCR的模板，并整合Illumina index序列引物。
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| ■ 产品组分 |
| 完整的工作流程需要下列Takara Bio产品。请参考User Manual得到一份完整的试剂耗材清单： |
| 用于ICELL8 cx Single-Cell System |
· ICELL8 cx TCR Chip (Code No. 640200)
· ICELL8 Human TCR a/b Profiling Reagent Kit (Code No. 640182)
· ICELL8 Human TCR a/b Profiling Indexing Primer Set (Code No. 640179, 640180, 640181)*
· ICELL8 Collection Kit-L (Code No. 640212)
· ICELL8 cx Loading Kit (Code No. 640197)
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| User Manual：ICELL8® cx Human TCR a/b Profiling user Manual |
| *NOTE：Code No. 640179包含的Primer量足够1张芯片使用，若实验中需要使用多张芯片，请购买合适的indexing primer set。640180适用于5张芯片的实验，640181适用于10张芯片的实验。 |
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| 图1 ICELL8 Human TCR a/b Profiling技术原理流程图 |
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| 图2 ICELL8 Human TCR a/b Profiling实验流程图 |
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| 使用ICELL8单细胞分选系统对T细胞和PBMCs样品进行单细胞分选及后续单细胞TCR克隆型分析（图3）和5’端差异表达分析（图4）。 |
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| 图3. T细胞与PBMCs的克隆型read计数 使用Excel对MiXCR软件输出结果进行筛选，为大于阴性对照（1X PBS）的TCRa和TCRb克隆类型定义一个read阈值（绿色实线为阈值线，对应read计数值为8）。数据使用统计软件JMP进行分析，并将结果绘制成箱图。图中点代表一个细胞中的TCRa（蓝色）和TCRb（红色）克隆型。阴性对照用于阈值设定，以便对分析样品和NTC（或低read克隆型）进行区分。Negative control 15个，Positive control 15个，T cells 530个，PBMCs 590个。 |
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| 图4. T细胞与PBMCs的5’端差异表达分析 使用与图3相同来源的cDNA进行单细胞5’端差异表文库构建，评估每个Barcode获得的reads数。箱图中每个点代表一个指定细胞中检测到的reads数。文库测序由NextSeq® 550测序平台完成，每个细胞产生平均30K reads。在PBMCs和T细胞中平均检测到～1,150个基因。Negative control 15个，Positive control 15个，T cells 530个，PBMCs 590个。 |
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| ■ 参考文献 |
| Litjens, Nicolle H. R., et al. Validation of a combined transcriptome and T cell receptor Alpha/Beta (TRA/TRB) repertoire assay at the single cell level for paucicellular samples. Front. Immunol., 11, (2020) |
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| 视频资料:《ICELL8系统T细胞受体测序（TCR-Seq）解决方案》 |
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