人ES/iPS细胞检测试剂盒

可检测未分化细胞数

rBC2LCN（AiLecS1）来源于Burkholderia cenocepacia，凝集素BC2L-C的N末端域在大肠菌表达的重组蛋白。 　　rBC2LCN对人类ES/ iPS细胞表面足糖萼蛋白的粘蛋白O-型糖链-H-3型（Fucα1-2Galβ1-3GalNAc）具有高亲和性，因此rBC2LCN被认为是可以检测人类ES/ iPS细胞的未分化标志物。 　　通过rBC2LCN把糖蛋白（H-3型聚合足糖萼）从人类ES/iPS细胞表面释放到培养液中。该试剂盒通过rBC2LCN和未分化标记抗体的Sandwich Assay测定法，定量测定从人类ES/iPS细胞表面释放到培养中的糖蛋白数量，进而可推算出人类ES/iPS细胞数。

◆特点

　●　通过对培养上清的分析，监测未分化细胞数的增减。

　●　因其测定对象为培养上清，不会在检查过程中消耗细胞数量，且可在此过程中继续进行细胞培养

　●　少量的培养上清（50μL）即可分析

　●　采用ELISA测定法，可简单快速的处理多样品

　试剂盒构成

构成品品名	容量×数量
rBC2LCN固相检测板	96 well×1板
HRP标识抗体溶液	400μL×1支
阴性对照品	1mL×1支
阳性对照品	100μL×1支
稀释溶液	15mL×1支
清洗液（10×）	100mL×1支
TMB溶液	10mL×1支
显色停止液	10mL×1支
封板贴	4片

◆原理

　●标准曲线制作

　　该试剂盒中未含有绘制标准曲线用的标准品。因此，请按照下述顺序调制标准品后，再行绘制标准曲线：

　　　1.　在未分化维持培养条件下进行人ES/ iPS细胞培养，更换培养基的第二天（18至24小时后）回收培养

　　　　　上清。

　　　2.　细胞剥离，测定人S/ iPS细胞数。

　　　3.　计算出回收到的培养上清中所含的人ES/ iPS细胞数。如：培养基量5mL，测定细胞数为5×10⁶cells

　　　　　时，则回收培养上清中的人ES/ iPS细胞数即为1×10⁶cells/mL。

　　　4.　利用回收的培养上清未分化维持用培养基或已分化培养基，制成已知细胞浓度的稀释系列，以绘制标准

　　　　　曲线。

◆分化诱导时的使用案例

　　　1.　在未分化维持培养时，对人ES/iPS细胞的培养上清进行取样，计算人ES/iPS细胞数。

　　　2.　在分化用培养基中对第1项的培养上清进行稀释，制成稀释系列，以绘制该试剂盒的标准曲线。

　　　3.　使用本试剂盒测定可确认人ES/iPS细胞数的培养上清。

　　　4.　推算分化条件下残存的人ES/iPS细胞数

【细胞株间和培养基间的比较】

　　在各个未分化维持用培养基（培养基A、B、C、D）中分别培养人类iPS细胞201B7株和253G4，更换培养基后第二天回收培养上清。计算细胞数量，用各个未分化维持用培养基将各培养上清稀释至2,000cells/mL，进而测定该试剂盒的吸光度。测定结果如下图所示。结果表明，即使细胞株或培养基等培养条件的细胞数量恒定，信号强度也有差异。因此，必须为培养条件绘制标准曲线。

【人类iPS细胞培养上清的测定】

　　用StemSure^® hPSC培养基培养人类iPS细胞201B7株，更换培养基第二天回收该培养基的培养上清。于此同时，计算细胞数量，阶段性的在StemSure^® hPSC培养基中稀释培养上清，并将稀释后的培养上清用试剂盒检测。结果可得到一个极高相关系数的线性公式。根据这个线性公式求出该培养条件下的人类iPS细胞检测下限值^※为108 cells/mL。

※检测下限值：根据培养基背景吸光度平均值+3.3SD和线性公式计算出来的细胞数量。

【分化细胞培养上清和人类iPS细胞培养上清液混合检测】

　　将含有成纤维细胞和人膝关节软骨（NHAC-kn）细胞的血清培养基上清与人类iPS细胞培养上清混合后，确认能否测定添加在其中的未分化细胞标志物。将iPS细胞混合比例0~20%（0～2×10⁴ cells/mL：总细胞数 1×10⁵ cells/mL）的人iPS细胞培养上清，混合到成纤维细胞和人膝关节软骨细胞培养上清中，用试剂盒检测。在血清和成纤维细胞存在的条件下，可在培养上清中测定出人iPS细胞培养上清。

　　另外还可从成纤维细胞/人膝关节软骨细胞和iPS细胞的混合试验材料中得出一个线性公式，根据该公式可求出人iPS细胞的检测下限值^※，分别为：170 cells/mL和96 cells/mL。

　使用注意项

　　●　由于细胞株、培养基种类等培养条件的不同，会导致信号轻度和细胞数的关系产生差异，所以必须绘制细胞

　　　  株、未分化维持培养条件、分化诱导培养基标准曲线。

　　●　不同培养条件下，不能依靠信号强弱来评定未分化性。未分化性的评定一定要在相同培养条件下进行。

　　●　用该试剂盒测算出来的ES/iPS细胞数与实际细胞数未必一致。对未分化维持状态和进行细胞分化的监控，也

　　　  是需要参考的指标之一。

欲了解更多相关资料请点击文字：无损监测具有致瘤性人ES/iPS细胞的技术

说明书.pdf

人类ES/iPS细胞测定试剂盒单页_1606WAAU01.pdf

●相关产品

　●荧光标识rBC2LCN
　　添加到人类ES/iPS细胞培养液中，可为人类ES/iPS活细胞染色。

产品编号	品名	规格	容量	保存温度·法规
180-02991	rBC2LCN-FITC【AiLecS1-FITC】 Ex.495nm,Em.520nm	细胞染色用	100μl
186-02993			100μl×5
186-03211	rBC2LCN-547【AiLecS1-547】 Ex.551nm,Em.565nm	细胞染色用	100μl
182-03213			100μl×5
185-03161	rBC2LCN-635【AiLecS1-635】 Ex.634nm,Em.654nm	细胞染色用	100μl
181-03163			100μl×5

　●rBC2LCN-PE23
　　仅加入含有人类ES/ iPS细胞的培养液中，可以选择性地杀死人类ES/ iPS细胞。

产品编号	品名	规格	容量	保存温度·法规
180-03231	rBC2LCN-PE23	细胞培养用	100μl
186-03233			100μl×5

　●rBC2LCN汽提溶液
　　可将与人类ES/ iPS细胞表面糖链聚合起来的rBC2LCN从细胞上剥落下来。rBC2LCN剥落后，细胞还可添加其他抗体进行染色、培养。

产品编号	品名	规格	容量	保存温度·法规
182-03171	rBC2LCN Stripping Solution【AiWashS1】	细胞培养用	10ml

　●BC2LCN凝聚素, 重组体、溶液
　　集中未标识的rBC2LCN

生产编号	品名	规格	容　量	保存温度·法规
029-18061	BC2LCN【AiLecS1】Lectin,recombinant, Solution	糖链研究用	1mg
025-18063			1mg×5

　●StemSure®hPSC培养基Δ
　　无饲养层细胞条件下可用于维持培养人类ES/iPS细胞的无血清液态培养基。原料不含动物体成分。

产品编号	品名	规格	容量	保存温度·法规
197-17571	StemSure®hPSC Medium Δ	细胞培养用	100ml
193-17573			100ml×4
064-05381	Fibloblast Growth Factor (basic),Human,   recombinant, Animal-derived-free 【bFGF/FGF2】	细胞生物学用	50μg
068-05384			100μg
060-05383			1mg
160-27051	hPSC Dissociation Solution 人类iPS細胞用单体细胞分散剂。不含酶、动物体来源材料。	细胞培养用	100ml

　●StemSure^®系列
　　通过小鼠ES细胞D3株或人类iPS细胞201B7株，进行品质测验。

产品编号	品名	规格	容量	保存温度·法规
197-16275	StemSure® D-MEM with Phenol Red and Sodium   Pyruvate	细胞培养用	500ml
197-16775	StemSure® Serum Replacement	细胞培养用	500ml
198-15781	StemSure® 10mmol/l 2-Mercaptoethanol Solution（×100）	细胞培养用	100ml
195-15791	StemSure® 50mmol/l Monothioglycerol Solution（×100） 可与2ME同等使用的还原剂。医药用外不适用。	细胞培养用	100ml
190-15805	StemSure® 0.1w/v% Gelatin Solution	细胞培养用	500ml
195-16031	StemSure® Freezing Medium 含有BSA的ES细胞・iPS细胞用冻存液	细胞培养用	100ml
197-17831	StemSure® hPSC Freezing Medium, AF 无动物体成分的人类ES·iPS细胞用冻存液	细胞培养用	100ml
199-16051	StemSure® LIF,Mouse,recombinant,Solution	细胞培养用	106units
195-16053			106units×10

　●Y-27632, MF
　　该品最为培养基添加物被登记在原药等登录原簿（MF）中。以自主规格为基础，实现原料管理、制造工程和分析实验的有效检验，创建可以恒常稳定产品品质的体制。＜点击此处＞

　●ES・iPS细胞研究用试剂
　　2007年iPS细胞确立发表后，许多与iPS细胞相关的文献纷纷发表。在各种各样的文献中报道出来的与ES细胞・iPS细胞の未分化能维持和分化诱导相关的低分子化合物也逐渐阵容化。＜点击此处＞

　●液态培养基・细胞培养用试剂
　　我们有着以液态培养基为首的平衡盐溶液、细胞剥离·分散液、抗生物质溶液、细胞外基质等丰富的产品种类。＜点击此处＞

Q：　培养上清中会有糖萼蛋白残留吗？

A：　糖萼蛋白会被释放到培养上清中。培养上清在37℃条件下保存8天，信号都不会减弱，因此作为本试剂盒测试

         对象的糖萼蛋白上的糖链在此期间都能保持其稳定性。如果冷冻保存的情况下，糖链安定性可稳定维持4个

         月。（但切记避免反复冻融。）

Q：　糖萼蛋白可作为标准品使用吗？

A：　该试剂盒是用于检测糖萼上的糖链的。因合成附有糖链的蛋白质很困难，所以生产出试剂盒适用的标准品也不

         易。虽然可能可以制作出不带糖链的糖萼蛋白，但是否能够作为标准品就不得而知了。

Q：　释放的足糖萼蛋白长度是恒定的吗？

A：　足糖萼蛋白是氨基酸配列恒定的，分子量为55kDa的蛋白质，但实际上足糖萼蛋白上还附有Ｏ型糖链、N型糖

         链和葡糖胺聚糖，分子量为240kDa以上的大型粘蛋白分子。因是由糖链修饰程度和性质不同的分子群混合起

         来的异质糖蛋白质群，分子量并不是恒定的。电泳分子量＞240kDa。

Q：　在三维细胞培养中，足糖萼蛋白也能释放出来吗？

A：　是的，三维培养中也能释放足糖萼蛋白。

Q：　足糖萼蛋白的作用是什么？

A：　足糖萼蛋白在人类iPS细胞中的机能暂时未知，但和未分化细胞的形态、增值性、分化能等有着密切的关系。

         它是发现肾脏肾小球足细胞的主要糖蛋白，在足细胞形态的形成和足细胞机能中起重作用。足糖萼蛋白缺失

         的小鼠，会引起肾脏异常致死。

Q：　回收培养上清时，是否需要进行混匀？

A：　是的。摇晃孔盘/孔板轻轻混匀后，再进行培养上清的回收。

Q：　阳性对照品和阴性对照品的使用目的是什么？

A：　用以确认试剂盒反应系是否正常进行。

Tateno, H., Onuma, Y., Ito, Y., Hiemori, K., Aiki, Y., Shimizu, M., Higuchi, K., Fukuda, M., Warashina, M., Honda, S., Asashima, M. and Hirabayashi, J.: Sci. Rep., 4, 4069 (2014).