骨吸收检测试剂盒

Bone Resorption Assay Kit

◆原理

 

       本产品是用于检测骨吸收作用的试剂盒，已预先铺在板上的磷酸钙首先与荧光素标记的硫酸软骨素结合（FACS），加入破骨细胞后，通过细胞的呼吸作用将FACS从磷酸钙层释放到培养基中，检测培养基中的荧光强度来评价骨吸收作用。此款试剂盒可用于骨生理代谢、药物评价等方面研究。

 

BONE RESORPTION ASSAY KIT 24	BONE RESORPTION ASSAY KIT 48

 

◆优点・特色

 

●　简单快捷——仅需检测荧光强度变化即可评估骨吸收能力

●　操作方便——观察骨吸收后形成的凹洞，仅需移除细胞。

●　准确清晰——可透过显微镜观察细胞形态，并可用图像软件分析吸收效果。

●　创新有效——使用标定荧光的磷酸钙来取代传统的牙质骨片。

●　产品已灭菌，即可使用

 

◆案例・应用

 

<药物作用巨噬细胞RAW264细胞系后实验检测>

 

1.剂盒的板里每孔加入FACS，37℃孵育1-2小时 2.PBS和培养基漂洗后，加入巨噬细胞RAW264细胞系孵育。培养的细胞已用细胞分化诱导剂 （RANKL）和药物处理过（约培养5-6天）。 3.养基转到96孔酶标板中，加入Assay Buffer。在入射光485nm、发射光535nm的条件下进行荧光强度检测。 4.分析吸收作用效果图，使用5%次氯酸钠处理可移走细胞，经过漂洗后，用显微镜拍照，最后用图像分析软件可分析吸收作用效果图。

注意：（1）使用无酚红培养基。（2）使用时请避光。

检测试剂盒
产品编号	名称	应用	规格	储存
PMC-AK03-COS	Acidic Mucopolysaccaride  Assay Kit	定量检测酸性粘多糖	1 kit  (100 tests)	4-10℃   勿冻
试剂盒组成 ●Chromogenic   Solution (4 mL) ——1  bottle ●Buffer (130 mL) ——1 bottle                   ●Enzyme Powder For Sample Preparation ——5 bottles ●Chondroitin Sulfate Standard Solution (100 µg/ml）(2 mL) —— 1 bottle
PMC-AK20-COS	Alkaline Phosphatase Staining Kit	检测成骨细胞碱性磷酸酶	1 kit (for 12   well plate×10）	4-10℃ 勿冻
试剂盒组成 ●Chromogenic   Substrate ——10 vials                     ●Substrate-containing Buffer (50 mL) ——1 bottle
PMC-AK21-COS	Calcified Nodule Staining Kit	检测成骨细胞钙化结节	1 kit (for 24 well   plate×10）	RT
试剂盒组成 ●Chromogenic   Substrate —— 10 vials                   ●Substrate-containing Buffer (×100)  (60 mL) —— 1 bottle
PMC-AK04F-COS	TRAP Staining Kit TRAP: 抗酒石酸酸性磷酸酶	检测破骨细胞抗酒 石酸酸性磷酸酶	1 kit(for 24 well plate×10）	4-10℃    勿冻
试剂盒组成 ●Chromogenic   Substrate——10 vials 每个试剂盒所包含试剂可用于 10 × 96-孔板 ●Tartrate-containing Buffer (50 mL)——1 bottle
294-67001	TRAP/ALP Stain Kit	骨代谢研究	60回用	-20℃
PMC-AK02-COS	Stains All Gel Staining Kit	酸性蛋白染色	1 kit (20 test)	RT
特色： 　 　酸性蛋白调节骨骼钙化，如骨钙素、骨桥蛋白和BSP，这些蛋白是骨骼和牙齿的重要成分。但这些酸性蛋白难以通过传统的SDS-PAGE凝胶染色来检测。 Stains All Gel    Staining Kit是针对这些难染色的强酸性蛋白设计，蛋白条带的颜色取决于蛋白的等电点和化学修饰，如糖基化和磷酸化。
试剂盒组成 ●Staining Stock   Solution ( ×10) ——40 mL ●Dilution Buffer —— 200 mL × 2
CSR-ARD-SET	Calcification Evaluation Set	检测成骨细胞钙化	1 SET	RT
试剂盒组成 ●Alizarin Red   Solution (CSR-ARD-A1) ——100 mL ●Calcified Nodule Extraction Solution(CSR-ARD-E1) ——100 mL

 

其他
产品编号	名称	检测样本	规格	储存
291-58601	LabAssay ALP	小鼠血清等	900 test	2-10℃勿冻
ALX-850-019-KI01	RANKL (total), soluble  (human)   ELISA kit	人血清、血浆、细胞培养液	96 well	4°C
APO-54N-028-KI01	Osteoprotegerin free (human),   detection set	人血清、血浆、细胞培养液	96 well	4°C
ALX-850-280A-KI01	Osteoprotegerin (human)   ELISA kit	人血清、血浆	96 well	4°C
ADI-900-215-0001	25(OH) Vitamin D ELISA kit	人血清、血浆	96 well	-20℃

骨吸收检测试剂盒

DATA SHEET.pdf

Method of Measuring Pit Area.pdf

BRA24KIT_E.20150529.pdf

骨吸收检测板/试剂盒【常见问题】

Q1：  培养基的使用量？
A1：   BONE RESORPTION ASSAY KIT 48×2 (CSR-BRA-48X2KIT)
       按照说明书，该试剂盒需要用分化培养基处理板子。1个板子，48孔，
       每个孔需用0.5mL分化培养基处理，每个孔加入细胞（细胞含有0.5mL分化培养基）。
       1个48孔板合计需要的分化培养基是48mL。2个48孔板，是96mL分化培养基。

       Osteoclast Culture Kit V-2 （PMC-OSC12-COS ）这个试剂盒中含有25mL的分化培养基。
       所以，Osteoclast Culture Kit V-2 （PMC-OSC12-COS ）里面的分化培养基25mL是远远不够用于BONE

       RESORPTION ASSAY KIT 48×2 (CSR-BRA-48X2KIT)的检测。

       Osteoclast Culture Kit V-2 （PMC-OSC12-COS ）即便里面的分化培养基不含酚红，也需要另外配置。

Q2：  如何配置不含酚红的培养基？
A2：   不含酚红的分化培养基配方：
       1）alpha-MEM（不含酚红），10%胎牛血清，1%双抗，50ng/Ml M-GSF,15ng/mL RANKL。
       Osteoclast Culture Kit V-2 中用的也是alpha-MEM。
       2）DMEM/F12（不含酚红），10%胎牛血清，1%双抗，50ng/Ml M-GSF,15ng/mL RANKL。
       Osteoclast Culture Kit V-2 中用的也是alpha-MEM不同。BONE RESORPTION ASSAY KIT 48×2
       (CSR-BRA-48X2KIT)试剂盒中用到的。

Q3： 在细胞孵育（5~6天）后，最佳的荧光检测时间是什么？什么时候荧光强度开始减弱？ 什么时候必须检测荧

      光强度？

A3：    最佳荧光检测时间取决于细胞和培养状态。所以我们推荐继续使用少量的条件培养基，研究荧光强度的上升

            曲线。

 

Q4：    板的保质期多久？

A4：    距离发货时间1年。

 

Q5：    板的荧光强度会随时间而减弱吗？

A5：    避光情况下，结合磷酸钙（CaP）的荧光标记硫酸软骨素（FACS）的荧光强度稳定。然而，部分荧光标记

            硫酸软骨素（FACS）在有培养基或者PBS时会被洗脱到培养基内。

 

Q6：    如果我用胰酶消化细胞做qPCR，磷酸钙（Ca-P）是否影响胰酶消化或者qPCR结果？

A6：    非常抱歉，我们没有实验过，也没有相关数据。

 

Q7：    我如何检测pit？与TRAP检测类似吗？需要检测pit的深度和宽度吗？（检测pit的面积不等于检测破骨细胞

            消化的pit体积）

A7：    Pit 检测（骨吸收活性）与TRAP检测不是很相似。按照说明书，pit检测中细胞的面积是在移除细胞后对板

            进行拍照测量。实际上，如您所说体积不应该在pit检测中测量。检测体积也比较困难。因此，pit面积或者

            pit数目经常检测。

 

Q8：    我该如何洗涤细胞？用缓冲液？检测荧光强度的pit 实验后。

A8：    用5%的次氯酸钠处理5分钟将细胞从板上移除，然后用水洗涤板，晾干。

 

Q9：    可用TECAN的活细胞影像仪器对板进行实时检测？

A9：    通常，我们会在新的96孔板内收集条件培养基，检测荧光强度。我们没有在培养过程中检测荧光强度。

 

Q10：    根据说明书，需要使用非酚红培养基培养细胞，我是否可以用其他不含酚红的培养基（不是说明书上提到

              的培养基）？这种培养基是否对细胞有不利影响？能否推荐其他不含酚红的培养基。我比较担心在磷酸钙

              （CaP）包被的培养板上培养细胞，不含酚红的DMEM或者其他培养基不能很好的支持细胞培养5天。在

              将细胞接种在磷酸钙（CaP）包被的培养板之前，我是否可以用含酚红的培养基培养细胞？我想培养

              RAW264.7 细胞和U937细胞。

              另外，5%的次氯酸钠是否也包含在试剂盒里？

A10：    在我们培养体系中，不更换培养基可以培养6天。如果客户担心6天培养的问题，我们推荐他试试在正常培

              养板中进行同样的培养，确认是否可以诱导破骨细胞。

              非常抱歉，我们这边没有用除了DMEM/F-12、αMEM之外的培养基。可以试试，确认是否能诱导破骨细

              胞。在最初培养的时候，可以用含酚红的培养基。但在检测时，需要更换成不含有酚红的培养基。

              5%的次氯酸钠不包括在试剂盒内。推荐使用Sodium Hypochlorite Solution（197-02206，Wako Pure

              Chemical Industries, Ltd.，）

 

Q11：    是否可用这种板检测正常骨髓破骨细胞分化实验？能否在实验结束时用TRAP染色细胞？

A11：    "BONE RESORPTION ASSAY PLATE" 可用于检测破骨细胞的骨吸收活性。破骨细胞的骨吸收活性与破骨

              前体细胞（骨髓或者RAW264.7细胞系）的骨吸收活性的差别是可以评估的。请注意在使用骨髓来源的破

             骨前体细胞时细胞 的选择。在骨髓实验中，该实验可能由于含有其他杂质导致进展不顺利，还可能在破骨

              细胞诱导时，需要检查M-CSF和RANKL的浓度是否足量。

 

              TRAP染色，我们没有这方面的经验，但是可以同时进行骨吸收检测和TRAP染色。破骨细胞吸收后，细胞

              仍然在细胞板上贴壁。如果希望结果清晰，我们推荐单一实验。

 

Q12：    是否可以兼容转染实验？是否会破坏包被？如果兼容的话，推荐什么转染方法？

A12：    在磷酸钙包被的板（CaP）上没有进行转染的实例。

              磷酸钙在细胞板上贴壁很牢。所以，如果没有酸或者强的外力，不会发生剥离。

 

              如果客户是做siRNA实验，推荐在转染后使用CaP板。因为核酸会吸收CaP，导致转染效率差。

 

Q13：    板是保存在室温还是4℃？

A13：    室温和4℃都可以保存。

 

Q14：    如果不是一次性用完所有的孔，这块板还能再用吗？因为整块板都会放在37℃培养细胞。

A14：    基本上我们不能保证上述使用的效果。但是，如果没有污染的话，未使用的孔都可以再使用。另外看，包

              被的CaP会和二氧化碳培养箱的湿气反应，可能会有点影响。

 

Q15：    是否可用于破骨细胞的检测（说明书是检测的RAW细胞）？如何用影像分析软件测量pit检测吸收？

A15：    非常抱歉，我们没有检测过不同分化的（成熟的）破骨细胞。如果含有其他细胞，会导致操作困难。

 

 

TRAP染色试剂盒常见问题

 

Q16：    该款试剂盒是否可用于石蜡包埋的组织？

A16：    非常抱歉，我们没有用这个做过石蜡包埋的组织。如果样品含有福尔马林的话，也不能用。

 

Q17：    操作说明书是可以做10×96孔板实验。能否介绍一下使用6孔板的步骤？

A17：    请使用96孔板的30倍试剂。比如显色试剂的量是1.5mL。

 

Q18：    是否可以染巨噬细胞？

A18：     可以。

 

Q19：    进行免疫荧光实验时，是否可以一起使用？如果可以，请告知实验流程。

A19：    我们没有用该试剂盒同时进行免疫荧光实验。

 

Q20：    如果显色底物溶解的话，在4℃可以保存多久？

A20：    非常抱歉，显色底物不能溶解后保存。最好现配现用。显色底物提供3mg/瓶，有10瓶。

 

Q21：    能够提供小包装？

A21：    目前不行。

 

【相关文献】

RANKL-dependent increase of fluorescence intensity of the conditioned medium (left) and pit area (right) from RAW264 cells in fluoresceinamine-labeled chondroitin sulfate (FACS)/ calcium phosphate (CaP)-coated plates (mean ± SD, n = 3, **: p<0.001).

The inhibitory effects of Pamidronate and β-Estradiol on calcium phosphate resorption induced by RANKL (100 ng/mL) were measured by fluorescence intensity (left) and pit area (right) (mean ± SD, n = 3, *:p<0.05, **: p<0.001).

（摘自参考文献[4]）

[1]	Chih-Hsin Kuo et al., arcinogenesis, 34. 11 2600-2609 (2013
[2]	Claire Fabre, Naoya Mimura, Katharyn Bobb, et al., Clin Cancer Res. 18, 4669-4681 (2012)
[3]	Kim J. et al., Cell. Biochem. 113:247-259 (2012)
[4]	Tatsuya Miyazaki. et al., Analytical Biochemistry 410 7-12 (2011)
[5]	Tatsuya Miyazaki. et al., Dental Materials Journal 29 4:403-410 (2010)