MagCapture™ microRNA分离试剂盒系列

　　本公司提供可实现从Ago免疫沉淀到RNA纯化一系列更简便操作的「microRNA Isolation Kit」系列产品。通过使用该系列产品，可便利地从人或小鼠的细胞、组织中回收Ago蛋白质结合microRNA以及目标mRNA。另外，从培养上清、血清、血浆中也可回收游离状态的Ago蛋白质结合microRNA。回收后的RNA可用于定量PCR、微阵列芯片（Microarray）、新一代序列分析等各种应用。该系列产品扩充至有采用了磁珠的MagCapture™ microRNA Isolation Kit和采用硅珠的，共8种试剂盒。

◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit（磁珠型）

　　该系列有抗人Ago2抗体（4G8）、抗鼠Ago2抗体（2D4）、抗Ago1-4抗体（1G3）包被磁珠的三种试剂盒以及含有可固定任意抗体的Protein G磁珠试剂盒，共计4款产品。这些试剂盒都采用磁珠，可更方便地进行重复性良好的免疫沉淀操作。在免疫沉淀后的纯化RNA步骤中，采用能获得高纯度RNA的离心柱法；此外，也可以采用含有抗Ago抗体包被磁珠的3种试剂盒的更简便的一步法。

试剂盒内容（例：Human Ago2, 10次用）

●　Anti-Human Ago2 Magnetic Beads Solution——600μL×1支

●　Cell Lysis Solution——20mL×1支

●　Washing Solution for IP——40mL×1支

●　Elution Solution I for IP—— 500μL×1支

●　Elution Solution II for IP——500μL×1支

●　Binding Solution for Spin Column——2mL×1支

●　Binding Enhancer for Spin Column——100μL×1支

●　Washing Solution I for Spin Column——3mL×1支

●　Washing Solution II for Spin Column—— 4mL×1支

●　Elution Solution for Spin Column——1mL×1支

●　Spin Column/Collection Tube——10支

◆概述图

 

产品名称	使用抗体克隆号	适应物种	对应样本	回收RNA	IP B/F 分离	RNA提纯
MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Human   Ago2	4G8	人、猴、狗	细胞/ 组织/血清/ 血浆	microRNA 和目标mRNA	磁力分离	离心柱法、一步法
MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Mouse   Ago2	2D4	小鼠、大鼠、狗
MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Ago   1-4	1G3	人、猴、狗,   小鼠、大鼠		microRNA
MagCapture™ microRNA Isolation Kit,   Protein G	随意	参照抗体	细胞/组织	参照抗体		离心柱法

 

◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Human Ago2 实验案例（人）

从人细胞系中回收microRNA

　　用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法（银染色）确认通过本产品（MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Human Ago2）从人K562细胞（1×10⁷ cells）中获得的microRNA（图1）。结果表明，使用本产品可获得高纯度的microRNA。此外，通过定量PCR法（miR-92a量），与使用原产品microRNA Isolation Kit, Human Ago2所获得的microRNA量相比较可知（图2），本产品的离心柱法显示与原产品几乎一样的microRNA回收性能；另外，在一步法中显示出了比原产品更优秀的microRNA回收性能。

 

图1.银染色检测从人K562细胞纯化的microRNA	图2.人K562细胞中纯化microRNA回收量的比较
LaneM：标记 Lane1：合成RNA寡聚核苷酸（23base）1ng Lane2：本品（Spin Column法） Lane3：本品（One Step法）

 

从人血浆中回收结合游离Ago蛋白质的microRNA

　　通过定量PCR法比较使用本产品和原产品从200μL正常人混合血浆中获取的microRNA量。结果显示，本产品的离心柱法与原产品具有几乎一样的microRNA回收性能；另外，在一步法中microRNA回收量比原产品多。（见图３）

图３．人血浆中纯化microRNA回收量的比较

microRNA的目标mRNA回收

　　向miR-122低表达的肝癌细胞株HepG2细胞（5×10⁵ cells）中导入人工合成的miR-122和调节用荧光素酶siRNA（Luc siRNA），使用本产品和原产品获得配制的Ago2 IP RNA以及用ISOGEN^®  配制的total RNA。通过定量PCR法比较各RNA种所含miR-122的量（图4）和其目标mRNA（目标基因中Aldo A mRNA的量用GAPDH mRNA的量补充）。（图5）。结果表明，与原产品一样，通过本产品获得的目标mRNA中，Aldo A mRNA和miR-122一同被浓缩，由此可知使用本产品可以获得microRNA的目标mRNA。另一方面，使用ISOGEN^® 获得的total RNA中，Aldo A mRNA随着miR-122的增加而逐渐分解减少。

图4.miR-122回收量的比较

图5.目标mRNA回收量的比较

◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2 实验案例（小鼠）

从小鼠细胞中回收microRNA

　　用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（银染色）确认通过使用本产品（MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2）从小鼠P388D1细胞（2×10⁷ cells）中获得的microRNA。（图1）结果表明，使用本产品可获得高纯度的microRNA。此外，通过定量PCR法（miR-92a量），与使用原产品（microRNA Isolation Kit, Human Ago2）所获得的microRNA量相比较可知（图2），本产品的离心柱法显示与原产品几乎一样的microRNA回收性能；另外，在一步法中显示出了比原产品更优秀的microRNA回收性能。

 

图1．银染色检测从小鼠P388D1细胞纯化的microRNA LaneM：标记 Lane1：合成RNA寡聚核苷酸（23base）1ng Lane2：本品（Spin Column法） Lane3：本品（One Step法）	图2．小鼠P388D1细胞纯化microRNA回收量的比较

从大鼠血浆中回收游离Ago2蛋白质结合microRNA

　　通过定量PCR法（miR-92a量）比较使用本产品和原产品从200μL大鼠血浆中获取的microRNA量。结果表明，本产品的离心柱法与原产品具有几乎一样的microRNA回收性能；另外，在一步法中microRNA回收量比原产品大。（图3）

图3.人血浆中纯化microRNA回收量的比较

◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Ago 1-4 实验案例（人）

回收Ago1-4结合microRNA

　　分别使用Ago1, Ago2, Ago3, Ago4特异性抗体对HeLa细胞中各RNA片段免疫沉淀处理后，进行微阵列芯片（3D-Gene^® ，东丽）分析。结果表明miR-22和miR-16多数被Ago2抗体吸收。另一方面，miR-1260b, miR-4286多数被Ago1, Ago3, Ago4吸收。（表1）

　　基于此解析结果，验证使用本产品（MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Ago1-4），是否可回收原产品（microRNA Isolation Kit, Human Ago2）中被Ago1, Ago3, Ago4吸收较为困难的microRNA。

 

                                                             表1. 微阵列芯片分析结果

	信号强度				信号比
Name	Ago1   IP	Ago2   IP	Ago3   IP	Ago4   IP	Ago2/Ago1	Ago2/Ago3	Ago2/Ago4
hsa-miR-22	3521.4	21696.5	3771.2	292.4	6.16	5.75	74.20
hsa-miR-16	6886.3	28527.2	5013.4	582.5	4.14	5.69	48.97
hsa-miR-1260b	2060.3	540.9	1270.6	1977.9	0.26	0.43	0.27
hsa-miR-4286	678.8	202.4	2019.2	471.2	0.30	0.10	0.43

 

图1.从HeLa细胞中回收的各microRNA量的比较

 

从人和小鼠细胞株中回收microRNA

　　通过定量PCR法（miR-92a量）比较使用本产品和原产品从人K562细胞（1×10⁷ cells）和小鼠P388D1细胞（2×10⁷ cells）中获取的microRNA量。结果表明，在同等条件下，使用本产品可获得更多的microRNA。（图2、图3）

 图2.人K562细胞中纯化microRNA回收量的比较                   图3.小鼠P388D1细胞中纯化microRNA回收量的比较

 

从人和大鼠血浆中回收游离Ago结合microRNA

　　通过定量PCR法（miR-92a量）比较使用本产品和原产品（microRNAIsolation Kit, Human Ago2或Mouse Ago2）从人和大鼠血浆中中获取的microRNA量。结果表明，在同等条件下，使用本产品可获得更多的microRNA。（图4、图5）

     图4.人血浆中纯化microRNA回收量的比较　　　　　　            图5.大鼠血浆中纯化microRNA回收量的比较

 

从各种动物细胞株中回收microRNA

　　通过定量PCR法（miR-92a量）测量使用MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Human Ago2、Mouse Ago2、Ago1-4从2×10⁶ cells的K562细胞（人）、COS-7细胞（猴）、MDCK细胞（狗）、P388D1细胞（小鼠）、SCC-131细胞（大鼠）中获取的免疫沉淀RNA片段中microRNA量和使用ISOGEN^®  从各种细胞中获取的total RNA片段中microRNA量。比较各免疫沉淀RNA片段中所含miR-92a 量和totalRNA片段中所含miR-92a量的相对值可知，本产品可在全部的细胞种类中获取microRNA。（图6）

图6.从各种细胞中获取的microRNA量的比较

 

◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Protein G 实验案例

从人和小鼠细胞株中回收microRNA（与原产品的比较）

　　通过定量PCR法（miR-92a量）比较在使用本产品（MagCapture™ microRNA Isolation Kit, ProteinG）和抗Ago1抗体（2A7）、抗人Ago2抗体（4G8）、抗人Ago3抗体（1C12）从人K562细胞（1×10⁷ cells）中获得的microRNA量以及使用原产品（microRNA Isolation Kit, Human/Mouse Ago1、Human Ago2、Human Ago3）获得的microRNA量（图1,2,3）。此外，通过定量PCR法（miR-92a量）比较在使用本产品和抗小鼠Ago2抗体（2D4）从小鼠P388D1细胞（2×10⁷ cells）中获得的microRNA量以及使用原产品（microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2）获得的microRNA量（图4）。结果表明，本产品和任意抗Ago抗体组合使用，获得的microRNA量要比原产品多。

从人和小鼠细胞株中回收各种Ago蛋白质结合microRNA

　　通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和定量PCR法（miR-92a量）研究在使用本产品和抗Ago1抗体（2A7）、抗人Ago3抗体（1C12）、抗Ago4抗体（2G7)从人K562細胞（1×10⁷cells）中获得的microRNA量（图5）。此外，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和定量PCR法（miR-92a量）研究在使用本产品和抗Ago1抗体（2A7）、抗小鼠Ago2抗体（2D4）、抗小鼠Ago3抗体（S09）、抗Ago4抗体（2G7)从小鼠P388D1细胞中获得的microRNA量（图6）。结果表明，本产品和任意抗Ago抗体组合使用，可获得各种Ago蛋白结合microRNA。

 

图1.抗Ago3抗体固定时microRNA回收量的比较 本产品：使用抗Ago1抗体（2A7） 原产品：microRNA Isolation Kit, Human、Mouse Ago1 （291-70201）	图2.人Ago2抗体固定时microRNA回收量的比较 本产品：使用抗人Ago2抗体（4G8） 原产品：microRNA Isolation Kit, Human Ago2 （292-66701）
图3.人Ago3抗体固定时microRNA回收量的比较 本产品：使用抗人Ago3抗体（1C12） 原产品：microRNA Isolation Kit, Human Ago3 （297-70301）	图4.小鼠Ago2抗体固定时microRNA回收量的比较 本产品：使用抗小鼠Ago2抗体（2D4） 原产品：microRNA Isolation Kit, Human、Mouse Ago2 （292-67301）

 

图5.从人K562细胞中纯化的microRNA回收量的比较和银染色检验

图6.从小鼠P388D1细胞中纯化的microRNA回收量的比较和银染色检验