NH₂-reactive HiLyte Fluor^TM 647是试剂盒的成分之一，它有一个琥珀酰亚胺基（NHS），能与蛋白质或者其它分子的氨基反应。该试剂盒中包含了标记所需的全部试剂。每一管NH₂-reactive HiLyte Fluor^TM 647最多能够标记200 μg的IgG，每个IgG分子可与4-6个HiLyte Fluor^TM 647分子共价结合。标记过程十分简单，只需要在特制的过滤膜上将NH₂-reactive HiLyte Fluor^TM 647加入到IgG溶液中，然后在37℃下培养10分钟。过量的HiLyte Fluor^TM 647能够用过滤管除去。被HiLyte Fluor^TM 647标记后的IgG的激发和发射波长分别为652 nm和673 nm。

* HiLyte Fluor^TM为AnaSpec,Inc公司的商标

使用注意事项:

1. 用该试剂盒标记的蛋白质的分子量要>50,000。

2. 在标记过程中，IgG或者HiLyte Fluor^TM 647-IgG标记物始终在Filtration tube的滤膜上。

3. 如果IgG溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质，如BSA或明胶时，在使用该试剂盒标记前，先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits（不包含于本试剂盒 中）来纯化。

4. 如果IgG溶液含有小的不溶物，离心后取上清液来进行标记。

5. 如果长时间不使用，建议您把试剂盒中的标记试剂NH₂-reactive HiLyte Fluor^TM 647放在-20℃冰箱中保存，不需要充氮气，可以更好地保持标记试剂的活性，但请不要把其它试剂和过滤管放到-20℃冰箱中，仍请放在0-5℃冰箱中保存。

标记IgG操作步骤

（1）将100μl WS buffer以及含有100μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。^a）

（2）8,000-10,000g离心10分钟。^b）

（3）将10μl DMSO加入到NH₂-reactive HiLyte Fluor^TM647中并用移液器吹打使其溶解。^c）

（4）将100μl Reaction buffer以及8μl NH₂-reactive HiLyte Fluor^TM647溶液加入到过滤管中，吹打使其混合。^d）

（5）将过滤管放入培养箱中，37℃培养10分钟。

（6）将100μl WS buffer加入到过滤管中，8,000-10,000g离心10分钟，^b）除去滤液。

（7）将200μl WS buffer加入到过滤管中，8,000g离心10分钟，^b）重复该步骤一次。

（8）将200μl WS buffer加入到过滤管中吹打10-15次来回收标记产物。^e）将该溶液转移到0.5ml试管中，在0-5℃下保存。

a）样品溶液的体积不应超过100μl。如果抗体浓度低于1mg/ml，重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到100μg。如果聚积过程中滤液的体积超过400μl，则在进行后续的离心操作前应除去滤液。

b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。

c）NH₂-reactive HiLyte Fluor^TM647在管子的底部，向管底加入10μl DMSO，吹打数次使其溶解。

d）如果IgG的量为200μg，加入所有的NH₂-reactive HiLyte Fluor^TM647溶液。

e）并不一定要使用WS buffer来回收标记产物，可以选择任何适合于该实验的缓冲液来替代。

1）荧光素标记的产品可以在大约2小时内制备。

2）可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。

3）可以标记50至200μg的蛋白质。

4）可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。

5）荧光素标记的物体可以与所附的存储溶液一起存储。