AcidSensor Labeling Kit – 细胞内吞作用的内化过程检测

AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay

商品信息

 

本款试剂盒一套试剂盒就包含了全部所需材料，可以对目标物质的内吞作用进行可视化分析。

 

试剂盒中包含的NH2-反应性AcidSensor（荧光探针）具有分子内活性酯基，与含氨基的目标物质（蛋白质）混合后形成稳定的共价键。AcidSensor标记后可在633纳米处被激发，可满足同时与绿色或红色荧光进行多重染色。

AcidSensor标记后在中性条件下几乎没有荧光，而在细胞中受环境酸化影响后会发出荧光，并被内吞作用所吸收。

*注意：

・与内吞作用的检测染料ECGreen（产品代码：E296）不同，本试剂盒是对进入细胞的目标物质进行染色。

本试剂盒可以标记分子量超过50,000和含有活性氨基的样本。

・本试剂盒也会标记分子量在10,000以上的除标记样本以外的含氨基的共存物质，这些物质也会被标记和回收。请在使用前对样品溶液进行纯化。

AcidSensor的反应原理与细胞内吞途径的示意图

THP-1 细胞对标记凋亡细胞的吞噬作用实验

AcidSensor 标记的物质会被细胞吸收，当它们到达溶酶体等酸性细胞器时，荧光会增强。利用这一特性，我们通过将 AcidSensor 标记的凋亡细胞与 Calcein 标记的 THP-1 巨噬细胞共培养来评估凋亡细胞的吞噬活性。 结果，通过流式细胞术观察到了钙蓝蛋白（绿色）/AcidSensor（深红色）双阳性细胞，表明 THP-1 巨噬细胞吞噬了凋亡细胞（图 1a）。此外，当细胞松弛素 D 抑制 THP-1 巨噬细胞的吞噬作用时，双阳性细胞的比例也会下降（图 1b 和 1c），这证实该检测系统能准确评估吞噬作用。

最近的一份报告显示，抑制线粒体功能会诱导培养的小胶质细胞（中枢神经系统中的常驻巨噬细胞）转向糖酵解并减少吞噬作用*。为了复制这一结果，我们使用线粒体抑制的 THP-1 巨噬细胞进行了吞噬试验。结果显示，短链氯化石蜡是线粒体氧化磷酸化的强效解偶联剂，它能降低 THP-1 巨噬细胞的线粒体膜电位（MT-1，红色）（图 2）并减少吞噬作用（图 3）。

使用产品：

①AcidSensor Labeling Kit – Endocytic Internalization Assay 【货号: A558】

② -Cellstain- Calcein-AM 【货号：C542】

③ MT-1 MitoMP Detection Kit 【货号：MT13】

实验步骤：

制备 AcidSensor 标记的凋亡细胞（检测前一天）

1. 向 NH2-Reactive AcidSensor 中加入 10 μl DMSO 并溶解。将 5 μl NH2-Reactive AcidSensor 溶液加入 5 ml HBSS，制成工作液（稀释 1000 倍）。

2. 用 HBSS 冲洗 Jurkat 细胞两次。

3. 将 Jurkat 细胞（5×107 个）转移到试管中，离心后去除上清液。

4. 将工作液加入到装有 Jurkat 细胞（5×107 个）的试管中并悬浮。

5. 5. 37°C 孵育 30 分钟，用 AcidSensor 进行标记。

6. 标记后，用 HBSS 冲洗细胞两次。

7. 将标记了 AcidSensor 的 Jurkat 细胞悬浮在含有 10%FBS、添加了 0.5 μM 石杉碱的 RPMI 培养基中。

8. 在培养箱（37°C，5% CO2）中隔夜培养 18 小时，诱导细胞凋亡。

使用 THP-1 巨噬细胞进行吞噬试验

1. 为了将 THP-1 细胞分化成巨噬细胞，将 THP-1 细胞以 1×106 个细胞/孔的数量播种到 6 孔板中，然后在培养箱中用 100 nM PMA 培养 3 天。

2. 2. 用 HBSS 冲洗 THP-1 巨噬细胞两次后，在孔中加入含 HBSS 溶液的 Calcein-AM（货号：C542，0.5 μg/ml）和 MT-1（货号：MT13，1000 倍稀释），在培养箱中培养 30 分钟。

3. 用培养液清洗两次。

4. 用 10 μM  Cytochalasin D培养 1 小时，或用 5 μM FCCP 培养 30 分钟。

5. 用培养液清洗两次后，将 AcidSensor 标记的凋亡细胞（3×106 个细胞/孔）加入到含有或不含细胞松驰素 D 或 FCCP 的孔中。细胞在培养箱中培养 4 小时。

6. 用 HBSS 冲洗两次。

7. 加入 500 μl Imaging 缓冲溶液（货号：MT13），用细胞刮板收集平板上的 THP-1 巨噬细胞。

8. 用流式细胞仪分析细胞悬浮液。

使用AcidSensor标记的BSA和小鼠IgG被HeLa细胞吸收的情况

使用该试剂盒将标记的BSA或小鼠IgG加入HeLa细胞中，2小时后观察HeLa细胞的吸收情况。

结果，在HeLa细胞中检测到了AcidSensor的荧光，证实两种标记的物体都被内吞途径吸收了。

＜检测条件＞

仪器:共聚焦显微镜

Ex = 633 nm, Em = 650-700 nm

与内体染料共染

标记的IgG的细胞摄取量随时间变化 

用本试剂盒的AcidSensor标记的小鼠IgG和Dojindo的内吞检测染料（货号E296, ECGreen -Endocytosis Detection）一同添加到HeLa细胞中。

染色后10分钟、20分钟和180分钟观察细胞，结果显示AcidSensor（深红色）和内体膜（绿色）在同一位置定位，表明小鼠IgG是通过内吞作用途径被细胞吸收的。

＜检测条件＞

绿：ECGreen

(Ex = 405 nm, Em= 500-550 nm)

紫：AcidSensor

(Ex = 633 nm, Em= 650-700 nm)

Q1: 样品溶液中存在的物质是否会影响标记反应？

A1: 取决于存在的物质种类。 在确认溶液中含有哪些物质后，对样品进行相应的纯化。 样品中共存的带有氨基的化合物和分子量超过10,000的化合物会降低标记效率，并且由于其分子量高，不能被过滤管去除。即使是没有氨基的化合物，高分子量的杂质也会造成过滤器的堵塞，从而影响标记和纯化。请在使用前对样品进行纯化。

Q2:回收标记体所使用的WS buffer是否有细胞毒性？

A2: WS buffer中含有几乎不会对细胞产生毒性的稳定剂（表面活性剂）。如果无论如何还是介意表面活性剂，可以根据自身习惯来选择合适的缓冲液来回收标记体。

Q3:如果用含有血清的培养基回收标记体，是否会影响观察？

A3: 血清中的成分虽然不会对AcidSensor的性能产生影响，但是由于血清中的蛋白质也会通过内吞途径进入细胞，可能会与标记的蛋白质的摄取产生竞争。请您根据自身实验目的进行判断。

Q4:如何计算标记率？

A4: A用WS buffer 5倍稀释标记体，然后检测500 nm和280 nm处的吸光度，按照下列公式进行计算，得出标记率。   A500： 500 nm 的吸光度 A280： 280 nm 的吸光度 εprotein： 蛋白质的280 nm处的摩尔吸光系数 NH2-Reactive AcidSensor 在WS buffer中的 A500 的摩尔吸光系数为[48400]。 NH2-Reactive AcidSensor 在280nm和500nm的吸光度、280nm/500nm的比值为[0.16]。

Q5:每个蛋白质分子上会有多少个AcidSensors标记上？

A5:对于小鼠IgG，我们已经确认每个分子平均有三个AcidSensors被标记。