LyoPrime Luna™ 探针一步法 RT-qPCR 预混冻干粉（含 UDG）用于灵敏检测靶标 RNA，可在室温条件下稳定保存。该冻干剂型与其液体剂型 [ Luna® 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液（含 UDG）（NEB #M3019）] 具备同样卓越的性能和功效。
· 加入无核酸酶水即可快速复溶
· 未经复溶的冻干试剂，可室温储存长达 2 年
· 无需冷链运输
· 单次检测通量多达 5 个靶标
· Luna 温启动反转录酶与 Taq 热启动 DNA 聚合酶联合使用，提高反应特异性及功效
· 优化的预混试剂中包含热敏 UDG 和 dUTP，防止模板残留污染
· 预混试剂还含有小鼠 RNase 抑制剂，可保持 RNA 的完整性
· 非荧光蓝色示踪染料避免加样错误
· 与多种 qPCR 仪器兼容，包括需要高 ROX 或低 ROX 参比信号的仪器
· New England Biolabs（简称 NEB） 和 Fluorogenics™ Limited（现为 NEB 的子公司）联合开发
LyoPrime Luna™ 探针一步法 RT-qPCR 预混冻干粉（含 UDG）可在室温条件下运输和保存。仅需加入无核酶水即可快速复溶并使用。该产品适用于水解探针法实时检测靶标 RNA。经优化可同时对高达 5 个靶标进行灵敏、线性的多重检测。稳定的冻干剂型可复溶成 2X 或 4X 浓度的预混液，以满足各种上样需求。
图 1：LyoPrime Luna 为冻干型通用 RT-qPCR 试剂，其性能卓越并可稳定保存
LyoPrime Luna™ RT-qPCR 预混冻干粉（NEB #L4001）与 Luna RT-qPCR 4X 预混液（NEB #M3019）具备相同的性能，该冻干剂型可在室温条件下运输和保存。
该预混冻干粉包含一步法 RT-qPCR 需要的所有组分，优化的缓冲液中含有 Luna 温启动反转录酶、Taq 热启动 DNA 聚合酶、dNTPs 和小鼠 RNase 抑制剂。Taq 热启动 DNA 聚合酶与新型温启动反转录酶联合使用，可通过基于适配体的可逆抑制来双重控制酶的活性。这种温控活化机制可避免热循环前的非特异扩增，可在复溶后室温建立体系。经基因工程改造的 Luna 温启动反转录酶具有更高的热稳定性，最佳反应温度为 55°C。此外，预混试剂中还添加了独特矫正染料，可与多种 qPCR 仪器兼容，包括需要高 ROX 或低 ROX 参比信号的仪器。
由于 RT-qPCR 灵敏度极高，因此避免 DNA 污染至关重要。该试剂含有热敏 UDG 和 dUTP，可防止模板残留污染（以往的扩增产物可作为后续反应的底物）。与 E.coli UDG 不同的是，热敏 UDG 在温度＞50℃时可完全失活，因此对反应没有影响。
试剂包含非荧光蓝色示踪染料，可避免加样错误。该示踪染料与 qPCR 常用荧光基团的光谱没有重叠，也不会干扰实时检测。
了解冻干工艺，或咨询定制服务以满足实验需求，请访问 www.neb.com/lyoprime。
图 2：冻干型和液体型 Luna RT-qPCR 预混试剂具备同样优异的性能
A. 使用 LyoPrime Luna™ 探针一步法 RT-qPCR 预混冻干粉（含 UDG）(NEB #L4001) 或 Luna® 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液（含 UDG）(NEB #M3019) 对人 β-actin 靶标进行 RT-qPCR 检测，模板上样量为 8-log 浓度梯度（1 μg–0.1 pg Jurkat 总 RNA），每个浓度重复 4 次，使用 ABI® QuantStudio™ 6 Flex 仪器运行试验。反应体系（20 μl）中，引物浓度为 400 nM，探针浓度为 200 nM，反应设置为产品推荐的循环条件。B. 冻干试剂（金色）和液体试剂（蓝色）的标准曲线基本相同，即使在最低测试浓度下也展现出良好的线性度和重复性。
图 3：LyoPrime Luna 多重检测性能卓越
使用 LyoPrime Luna™ 探针一步法 RT-qPCR 预混冻干粉（含 UDG）对 6-log 浓度梯度的 Jurkat 总 RNA（1 μg-10 pg）进行多重 RT-qPCR，实验仪器为 Bio-Rad CFX96 荧光定量仪。结果显示了 5 个人源靶基因的扩增标准曲线和扩增效率。反应体系（20 μl）中，引物和探针浓度均为 200 nM，反应设置为产品推荐的循环条件。在该多重反应中，5 个靶标均检测到良好的线性度、扩增效率和 R2 值。
图 4：LyoPrime Luna 冻干剂型与其液体剂型性能一致，且优于其它品牌
两位实验人员按照操作说明书，使用市售冻干 RT-qPCR 试剂分别对 8 个不同丰度、长度和 GC 含量的靶标（通过不同颜色显示）进行一步法 RT-qPCR 测试。反应结果就以下方面进行评估：扩增效率、低样品量检测能力及无模板扩增值（ΔCq=无模板对照的平均 Cq-最低起始量的平均 Cq）。此外，还评估了扩增结果的一致性、可重复性和总体曲线质量。结果显示：LyoPrime Luna™ 探针一步法 RT-qPCR 预混冻干粉（含 UDG）（NEB #L4001）与其液体剂型 Luna® 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液（含 UDG）（NEB #M3019）性能一致，且优于其它冻干产品，
了解 qPCR/RT-qPCR 综合测试和“dots in boxes”点阵图分析方法，请点击https://www.neb.com/tools-and-resources/video-library/dots-in-boxes-visualization-of-qpcr-data
图 5：冻干型和液体型 Luna 试剂均可对 SARS-CoV-2 病毒 RNA 进行灵敏检测
本实验使用 Luna SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒（NEB #E3019）中的引物和探针对 2019-nCoV_N1（N1, HEX）、2019-nCoV_N2（N2, FAM）和人源 RNase P（RP, Cy5）进行多重 RT-qPCR 检测，实验仪器为 Bio-Rad® CFX384 荧光定量仪。反应体系（5 μl）中，引物浓度为 400 nM，探针浓度为 200 nM，反应设置为产品推荐的循环条件。实验样品：将 Twist 公司合成的 SARS-CoV-2 RNA 对照 2 掺入到 5 ng/μl Jurkat 总 RNA 中。LyoPrime Luna RT-qPCR 冻干剂型与其液体剂型均展示出良好的线性定量能力（对于 5 和 10 拷贝的 SARS-CoV-2 RNA，N1 和 N2 基因 40 个重复的检出率为 100%，28 个阴性对照重复均无假阳性）。在 96 孔板中测试的 20 μl 体系结果相同。
图 6：LyoPrime Luna 试剂可对不同传染病靶标进行检测和定量
分别使用病毒 RNA 基因（FAM）和人源 RNase P（Cy5）靶标的引物和探针进行 RT-qPCR 实验，实验仪器为 Bio-Rad CFX96 荧光定量仪。试验样品：将 100,000-10 拷贝的 ATCC® 合成病毒 RNA（基孔肯雅病毒：VR-3246SD；2 型登革热病毒：VR-3229SD；寨卡病毒：VR-3252SD）掺入到 5 ng/μl 人源（Jurkat）总 RNA 中。每个靶标使用其对应的 ATCC 参考引物和探针序列。反应体系（20 μl）中，引物浓度为 400 nM，探针浓度为 200 nM，反应设置为产品推荐的循环条件。结果显示：LyoPrime Luna RT-qPCR 预混冻干粉对于所有靶标的线性定量和检测结果均非常理想。
