细胞内葡萄糖吸收检测试剂盒

 

 

 

◆原理

 

胰岛素是降血糖的激素，它能够以脂肪细胞或者骨骼肌等为中心促进糖输送活性，将糖从细胞外吸收到细胞内。

测定糖的吸收量一般是使用³H标记的3-O-甲基-D-葡萄糖和2-脱氧葡萄糖（2DG）的方法。这种方法需要用同位素，所以只能在RI管理区域内使用，在一般的实验室也无法使用。

本试剂盒使用安全，操作简单，用non-RI法能够简便地测定细胞内糖吸收量。

 

试剂盒测定

 

细胞吸收的2DG会在己糖激酶的催化下会被2-脱氧葡萄糖-6磷酸（DG6P）氧化，不继续进行酶反应而是留在细胞内。

本试剂盒是在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）的酶反应下，生成2DG6P成比例地生成NADPH，然后NADPH发生氧化生成荧光基质后就可以测定荧光物质的荧光强度。

 

 

◆优点・特色

 

●　检测2-deoxyglucose (2DG) (葡萄糖类似物) 摄入的总量 

●　葡萄糖，2DG被细胞摄取后，在己糖激酶作用下，迅速磷酸化为2-脱氧葡萄糖-6-磷酸（2DG6P）。而2DG6P在细胞内聚集，不会发生进行代谢。

●　细胞裂解物中的2DG6P在耦合酶作用下，产生荧光信号，其强度与2DG6P的量正相关。

●　利用已知2DG6P的标准曲线，对照检测的荧光强度计算样品2DG水平

 

相关产品比较

	【本试剂盒】 Measurement Kit, Broad Range, Fluorometric     (Cat. No. MBR-PMG-K01E)	【相关产品】 2-Deoxyglucose (2DG) Uptake Measurement Kit   Cat. No.： CSR-OKP-PMG-K01E
测定方法	Non-RI法	Non-RI法
操作时间	3小时	5~7小时（2天）
检测方法	荧光（Ex 540nm/Em 590nm）	发光（420nm）
特征	测定范围广（0~50μm）能够迅速进行测定 可以使用高通量法一步测定	高灵敏度（0~5μm）定量检测试剂盒

 

 

◆案例・应用

 

试剂盒组成

 

试剂	规格	数量	储存（开封后）
2DG6P Solution   (1 mM)	500 μL	3 x 3 ml	-20°C (避光)
Sample Diluent   Buffer Concentrate (100x)	5 ml	1 vial
Substrate Buffer	9 mL	1 vial
Fluorescent   Substrate	120 μL	1 vial
Enzyme Solution	270 μL	1 vial

该试剂盒可进行100次反应

 

需要准备：

●　超纯水（蒸馏水）

●　2-deoxyglucose 建议产品

●　牛血清白蛋白建议产品

●　96-well黑色多孔板 

●　96-well荧光酶标仪 （激发波长540nm 荧光波长590nm）

●　超声波细胞裂解装置

 

 

胰岛素刺激3T3-L1细胞分化后2DG的摄取情况

 

            

 

※具体操作见“相关资料”

 

胰岛素刺激3T3-L1细胞分化及样品制备

       对于您实验的细胞，需要根据细胞本身的情况优化培养基和各项条件，如实际浓度、培养时间及其他实验相关参数。
       以下是标准12孔培养板的3T3-L1细胞操作步骤。

试剂和培养基
･Serum-free culture medium
･Krebs Ringer Phosphate HEPES (KRPH) buffer at 37°C
(1.2mM KH2PO4, 1.2mM MgSO4, 1.3mM CaCl2, 118mM NaCl, 5mM KCl, 30mM Hepes, pH7.5)
･BSA (essentially fatty acid free and globulin free grade, use Sigma Ca. No. A0281 or equivalent)
･2-Deoxy-D-glucose (2DG) solution
･ Insulin solution
･ PBS(-)
･Phloretin or Cytochalasin B (or other glucose uptake inhibitor)

细胞样品制备

1) Differentiate 3T3-L1 cells to adipocytes in a 12-well culture plate.

2) Replace culture media with serum-free medium. Return to incubator for 6 hours.

3) Gently wash cells 3 times with 1.5mL of warm KRPH buffer without BSA?.

4) Gently add 3mL of warm KRPH buffer containing 2% BSA.

加入胰岛素

5) For this example, insulin is added to a final concentration of 1μM .

6) Incubate cells for 18 min at 37°C.

加入2DG

7) For this example, 2DG is added to a final concentration of 1mM.

8) Incubate cells at 37 C for 20 minutes.

9) Wash cells gently 3x with cooled PBS containing 200μM Phloretin to inhibit further 2DG uptake.

细胞裂解及样品制备

10) Add 1.5mL of 1x Sample Diluent Buffer.and lyse cells by sonication with a microtip sonicator.

11) Collect cell lysate to tube, and apply heat treatment at 80°C for 15 minutes.
　　　　Note: Do not add protease inhibitors to cell lysates.
　　　　Note: If an alternate method for cell lysis will be used, do not use NaOH as NaOH degrades 2DG6P.

12) Centrifuge lysates at 15000 x g for 20minutes at 4°C

13) Transfer cell lysate supernatants to a fresh tube. These cell lysate supernatants are your experimental samples.
　　　　Note: Supernatants can be stored at -20°C for later analysis.

检测细胞裂解液中的2 DG
 　　14) Follow the procedure of [Section III-1] “2DG Measurement Protocol” above.

【参考文献】

[1];Yamamoto N, et al ,(2006). A nonradioisotope, enzymatic assay for 2-deoxyglucose uptake in L6 skeletal muscle cells cultured in a 96-well microplate. Anal. Biochem. 351: 139-145.