磁珠型microRNA分离试剂盒

FUJIFILM Wako提供能使从Ago 免疫沉淀到RNA 提取等一系列实验操作简化的“microRNA Isolation Kit”系列。使用本系列试剂盒能简便地从人和小鼠的细胞或组织中提取Ago蛋白结合的microRNA以及靶mRNA，还能从培养上清、血清、血浆中提取游离Ago蛋白结合的microRNA。所提取到的RNA可以应用于qPCR、微阵列检测、NGS等下游实验。本系列包括采用磁珠的MagCapture™ microRNA Isolation Kit，以及采用了硅胶珠法的microRNA Isolation Kit。

MagCapture™ microRNA Isolation Kit（磁珠法）系列产品包括含抗人Ago2抗体（4G8）、抗小鼠Ago2抗体（2D4）、抗Ago1-4抗体（1G3）固相化磁珠这三种试剂盒，以及第四种——能结合任意抗体的Protein G磁珠。上述试剂盒全部采用磁珠法，可进行简易的免疫沉淀操作并获得良好的重复性。免疫沉淀后提取的RNA可进一步使用离心柱纯化，获得高纯度的RNA；若使用含有抗Ago抗体固定化磁珠的3种试剂盒，也可使用一步法更加简便地提取RNA（备注：RNA与磁珠不分离）。

◆试剂盒组成（例：Human Ago2, 10次用）

  1.　Anti-Human Ago2 Magnetic Beads Solution：600 μL×1瓶

  2.　Cell Lysis Solution：20 mL×1瓶

  3.　Washing Solution for IP：40 mL×1瓶

  4.　Elution Solution I for IP：500 μL×1瓶

  5.　Elution Solution II for IP：500 μL×1瓶

  6.　Binding Solution for Spin Column：2 mL×1瓶

  7.　Binding Enhancer for Spin Column：100 μL×1瓶

  8.　Washing Solution I for Spin Column：3 mL×1瓶

  9.　Washing Solution II for Spin Column：4 mL×1瓶

10.　Elution Solution for Spin Column：1 mL×1瓶

11.　Spin Column/Collection Tube：10瓶

◆操作示意图

◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit，Human Ago2 使用例子（人）

提取人细胞株中的microRNA

通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（银染），检测使用本品（MagCapture™ microRNA Isolation Kit，Human Ago2）从人K562细胞（1×10⁷ cells）中提取的microRNA（图1）。结果显示，本系列试剂盒可提取得到高纯度的microRNA。通过qPCR对miR-92a进行定量，比较使用本品和硅胶珠型产品（microRNA Isolation Kit，Human Ago2）提取的microRNA量（图2）。本系列试剂盒的离心柱法具有几乎与硅胶珠法相同的microRNA提取能力，而且一步法的microRNA提取能力比硅胶珠法更好。

图1.　对从人K562细胞中提取的microRNA的进行银染检测

图2.　比较从人K562细胞中提取的microRNA量

提取人血浆中的游离Ago2蛋白结合microRNA

以qPCR对miR-92a进行定量，比较使用磁珠型MagCapture™ microRNA Isolation Kit，Human Ago2和硅胶珠型产品从200μL健康人混合血浆中提取的microRNA量。结果发现，本试剂盒中的离心柱法具有几乎与硅胶珠型产品相同的microRNA提取能力，而且一步法的microRNA提取量比硅胶珠型高（图3）。

图3.　比较从人血浆中提取的microRNA量

提取microRNA的靶标mRNA

向miR-122低表达的肝癌细胞株HepG2细胞（5×10⁵ cells）导入人工合成的miR-122或调控的荧光素酶siRNA（Luc siRNA），提取了分别用磁珠型MagCapture™ microRNA Isolation Kit，Human Ago2和硅胶珠型产品制备的Ago2 IP RNA，以及用ISOGEN^® 制备的total RNA。运用qPCR法比较各种RNA中含有的miR-122量（图4）与其靶标mRNA（Aldo A mRNA是miR-122靶标之一，以GAPDH内参作校正）量（图5）。与硅胶珠型产品一样，本品提取的RNA中富集了miR-122和Aldo A mRNA，因此，可以利用本品提取microRNA的靶标mRNA。另一方面，用ISOGEN^® 制备的total RNA中的Aldo A mRNA会随着miR-122的增加而分解并减少。

图4.　miR-122提取量的比较

图5.　靶标mRNA提取量的比较

◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2 使用例子（小鼠）

从小鼠细胞株中提取microRNA

通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（银染），检测用本试剂盒（MagCapture™ microRNA Isolation Kit，Mouse Ago2）从小鼠P388D1细胞（2×10⁷ cells）中提取的microRNA（图1）。结果显示，本品能提取出高纯度的microRNA。另外，以qPCR法对miR-92a进行定量，比较使用硅胶珠型产品（microRNA Isolation Kit，Mouse Ago2）提取到的microRNA量（图2）。结果发现，本品的离心柱法具有与硅胶珠型产品几乎同样的microRNA提取能力，而一步法的microRNA提取能力比硅胶珠型产品更好。

图1.　对从小鼠P388D1细胞中提取的microRNA的进行银染检测

图2.　比较从小鼠P388D1细胞中提取的microRNA量

从大鼠血浆中提取游离Ago2蛋白结合microRNA

通过qPCR对miR-92a进行定量，比较使用本品以及硅胶珠型产品从200μL大鼠血浆中提取到的microRNA量。本品的离心柱法具有与硅胶珠型产品几乎同样的microRNA提取能力，而一步法的microRNA提取能力比硅胶珠型产品更好（图3）。

图3.　比较从大鼠血浆中提取的microRNA量

◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Ago 1–4 使用例子（人）

提取Ago1–4结合microRNA

用各种Ago1、Ago2、Ago3、Ago4特异性抗体进行微阵列检测分析免疫沉淀后HeLa中的各个RNA组分，结果显示，Ago2中捕获了大量miR-22和miR-16，而Ago1、Ago3、Ago4中则捕获了大量的miR-1260b和miR-4286（表1）。

	信号强度				信号比
名称	Ago1 IP	Ago2 IP	Ago3 IP	Ago4 IP	Ago2/Ago1	Ago2/Ago3	Ago2/Ago4
hsa-miR-22	3521.4	21696.5	3771.2	292.4	6.16	5.75	74.2
hsa-miR-16	6886.3	28527.2	5013.4	582.5	4.14	5.69	48.97
hsa-miR-1260b	2060.3	540.9	1270.6	1977.9	0.26	0.43	0.27
hsa-miR-4286	678.8	202.4	2019.2	471.2	0.3	0.1	0.43

表1.　微阵列检测分析结果

上述分析结果验证了我们可以利用MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Ago1-4，从Ago1、Ago3、Ago4中提取硅胶珠型产品难以提取的大量microRNA。

使用本品和硅胶珠型产品，提取HeLa细胞（1×10⁷ cells）中的microRNA，以miR-92a作为内部标准，通过qPCR检测miR-22、miR-1、miR-1260b、miR-4286的提取量。结果发现，Ago1、Ago3、Ago4中miR-1260b、miR-4286的提取量比硅胶珠型产品更高（图1）。因此，本品不仅能提取Ago2中的microRNA，还能从Ago1、Ago3、Ago4中提取硅胶珠型产品难以提取的大量microRNA。

图1.　比较从HeLa细胞中提取的各种microRNA量

提取人和小鼠细胞株中的microRNA

以qPCR对miR-92a进行定量，比较用本品和硅胶珠型产品（microRNA Isolation Kit, Human Ago2或Mouse Ago2）从人K562细胞（1×10⁷ cells）及小鼠P388D1细胞（2×10⁷ cells）中提取的microRNA量。结果显示，本品可提取和硅胶珠型产品相同甚至更多的microRNA（图2，3）。

图2.　比较从人K562细胞中提取的microRNA量

图3.　比较从小鼠P388D1细胞中提取的microRNA量

提取人和大鼠血浆中的游离Ago结合microRNA

以qPCR对miR-92a进行定量，比较用本品和第一代产品（microRNA Isolation Kit, Human Ago2或Mouse Ago2）从200μL人以及大鼠血浆中提取的microRNA量。结果显示，本品可提取和硅胶珠型产品相同甚至更多的microRNA（图4,5）。

图4.　比较从人血浆中提取的microRNA量

图5.　比较从大鼠血浆中提取的microRNA量

提取各种动物细胞株中的microRNA

以qPCR对miR-92a进行定量，检测用MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Human Ago2、Mouse Ago2、Ago1-4从2×10⁶ cells的K562细胞（人）、COS-7细胞（猴）、MDCK细胞（狗）、P388D1细胞（小鼠）、SCC-131细胞（大鼠）中提取的免疫沉淀组分中的microRNA量，和用ISOGEN^® 从各种细胞中提取的total RNA组分中的microRNA量。通过比较各种免疫沉淀所得到的RNA组分中的miR-92a量和total RNA组分中的miR-92a量的相对值，表明本品适合提取上述全部细胞中的microRNA（图6）。

图6.　比较从各种动物细胞中提取的microRNA量

◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Protein G使用例子

提取人和小鼠细胞株中的microRNA（与硅胶珠型产品的比较）

以qPCR法对miR-92a进行定量，比较用本品（MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Protein G）和抗Ago1抗体（2A7）、抗人Ago2抗体（4G8）、抗人Ago3抗体（1C12）从人K562细胞（1×10⁷ cells）提取的microRNA量，和用硅胶珠型产品（microRNA Isolation Kit, Human/Mouse Ago1、Human Ago2、Human Ago3）提取的micro RNA量（图1,2,3,）。另外，以qPCR对miR-92a进行定量，比较用本品和抗小鼠Ago2抗体（2D4）从小鼠P388D1细胞（2×10⁷ cells）中提取的microRNA量，和用硅胶珠型产品（microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2）提取的microRNA量（图4）。结果发现，本品与任意抗Ago抗体结合使用，能比硅胶珠型产品提取到更多的microRNA。

图1.　比较结合了抗Ago1抗体时的microRNA提取量

图2.　比较固定抗人Ago2抗体时的microRNA提取量

图3.　比较固定抗人Ago3抗体时的microRNA提取量

图4.　比较固定抗小鼠Ago2抗体时microRNA的提取量

提取人与小鼠细胞株中各种Ago蛋白结合microRNA

通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和qPCR，对用本品和抗Ago1抗体（2A7）、抗人Ago2抗体（4G8）、抗人Ago3抗体（1C12）、抗Ago4抗体（2G7)从人K562细胞（1×10⁷ cells）中提取的miR-92a表达量进行检测（图5）。另外，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和qPCR（miR-92a量），检测用本品和抗Ago1抗体（2A7）、抗小鼠Ago2抗体（2D4）、抗小鼠Ago3抗体（S09）、抗Ago4抗体（2G7)从小鼠P388D1细胞（2×10⁷ cells）中提取的microRNA量（图6）。结果表明，本品与任意的抗Ago抗体组合使用，能提取与各种Ago结合的microRNA。

图5.　从人K562细胞中提取的microRNA量的比较与银染检测

图6.　从小鼠P388D1细胞中提取的microRNA量的比较与银染检测

◆产品列表

产品编号	产品名称	使用 抗体 克隆号	对应 物种	对应样本	提取RNA	IP   B/F 分离法	RNA 提取法
295-74001	MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Human Ago2 MagCapture™ microRNA 分离试剂盒，人Ago2	4G8	人、猴、狗	细胞/ 组织 血清/ 血浆	microRNA 靶标mRNA	磁力 分离	离心 柱法 一步法
297-74201	MagCapture™ microRNA Isolation Kit，Mouse Ago2 MagCapture™ microRNA 分离试剂盒，小鼠Ago2	2D4	小鼠、大鼠、狗
293-74801	MagCapture™ microRNA Isolation Kit，Ago 1-4 MagCapture™ microRNA 分离试剂盒，Ago1-4	1G3	人、猴、狗、小鼠、大鼠		microRNA
299-74401	MagCapture™ microRNA Isolation Kit，Protein G MagCapture™ microRNA 分离试剂盒，蛋白G	随意 选择	根据使用的抗体而定	细胞/ 组织	根据使用的抗体而定		一步法