激酶分析筛选试剂盒

Fluorospark^® Kinase/ADP Multi-Assay Kit

　　Fluorospark^® Kinase/ADP Multi-Assay Kit是和光与日本东京大学新药研究机构共同研发的ADP荧光检测试剂盒。拥有高通量筛选（HTS）所必须的高灵敏度、高准确度、低成本、简便等特性。本产品不仅可检测激酶，同时可用于检测产生ADP的酶（如ATP酶、乙酰基—CoA羧化酶）的活性。

◆原理：

　　本试剂盒通过酶偶联反应简单、高灵敏度的定量检测ADP。通过激酶反应产生的ADP用红色荧光物质试卤灵定量。

◆优点、特色：

●   适合终点(endpoint)和实时实验

●   优异的Z'-factor数据（数据差异小）

●   高灵敏度检测ADP量

●   检测直到ADP 30μmol/L仍可保持线性关系

●   一步反应，检测时间短（~30分钟）

●   成本较低

与传统方法（发光）比较

试剂名称	Fluorospark® Kinase	传统发光法（A公司）
原理	ADP定量（荧光）   （直接定量生成的ADP）	ADP定量（发光）   （需要把生成的ADP变换成ATP再定量）
操作顺序	1步	2步
所需时间	30分钟	70〜100分钟
ADP定量范围	〜30μmol/L	〜1mmol/L
价格	低成本	高成本
优点	Z'-factor数值高   适合实时、终点反应	动态范围大   S/B比高

 

◆试剂盒组成

No. 试剂	用途	1,000次	10,000次
底物液	2×制备检测液	9mL	90mL
酶液		500μL	5mL
刃天青液		100μL	1mL
还原封闭剂		400μL	4mL
D　终止液	停止偶联反应	10mL	100mL
10mmol/L　ATP溶液	激酶反应，制作标准曲线	100μL	1mL
10mmol/L　ADP溶液	制作标准曲线	100μL	1mL

◆案例、应用：

【实验流程（终点（endpoint）法）】

　　激酶反应液里添加等量的2x检测液（使用时制备）即可检测激酶活性

【制作ADP标准曲线】

用0、10、20、30μmol/L ADP制作标准曲线。

　　良好的线性关系可定量最多至30μmol/L的ADP。

【低浓度ADP区域里定量】

制作各ATP/ADP浓度（ATP+ADP=1,10,100μmol/L）里底物变换率0-10%标准曲线

　　ATP/ADP标准曲线里底物变换率低（=ADP浓度低）时线性关系依然较好

 

【荧光信号的稳定性】

20μmol/L ADP和2x检测液混合，在30分钟~7小时候检测荧光强度。30分钟后的荧光强度标准化为100%，相关变动表格如下。

　　ADP和2x检测液混合后，在30分~7小时内的荧光信号十分稳定。

【数据：Z'-factor实测值】

定量与各ATP/ADP浓度（ATP+ADP=1,10,100μmol/L），5%底物变换率相当的ADP时，本试剂盒方法与传统发光法的Z'-factor比较。

　　Z'-factor：Fluorospark^® Kinase >传统发光法（A公司）

　　在各ATP浓度里，5%低底物变换率也有优异的Z'-factor。

什么是Z'-facotr
　　是一个关于信号区间和变异的组合，它已成为评估测试方法质量的主要参数。使用Z'-factor = 1 – (3×SDH + 3×SDL)/(AvH-AvL)公式计算（SDH和SDL为阳性对照和阴性对照的方差，AVH和AVL为阳性对照和阴性对照的平均值）。

Z-factor	Interpretation
1.0	理想情况下等于1.0。Z factor永远不可能超过1.0。
0.5 – 1.0之间	较好的实验。
0 – 0.5 之间	临界的实验（较差的实验）。
小于0	阳性对照和阴性对照的数值有很多重叠。

【制作抑制曲线】

　　制作cAMP- 依赖性蛋白激酶(PKA)抑制剂H-89的抑制曲线

　　（PKA 0.02U/μL，ATP 5μmol/L，Kemptide 125μg/mL及各浓度的H-89）

　　Fluorospark^® Kinase与传统发光法（A公司）有几乎相同的IC₅₀值。

　　（本方法得到的H-89 IC₅₀值与文献值*（IC₅₀=40nmol/L）几乎相同）

　　* Hidaka, H. et al., Methods Enzymol., 201, 328-39(1991).

【实验流程（实时法）】

　　通过实时检测荧光强度，实时检测激酶活性。

【ADP定量反应时间的比较（实时检测）】

　　对各浓度ADP［ADP=0, 0.25, 0.5, 1, 2μmol/L（ATP+ADP=10μmol/L）］进行实时检测。

　　Fluorospark^® Kinase在约十分钟内完成ADP定量反应。背景（ADP=0μmol/L）信号稳定。

【实时检测添加DTT的影响】

　　ADP=2μmol/L（ATP+ADP=10μmol/L）里添加还原剂DTT（0.1、1mmol/L），进行实时检测。

　　Fluorospark^® Kinase在约十分钟内完成ADP定量反应。即使DTT浓度增高，结果依然稳定。

【通过实时检测计算PKA的Km（ATP）值】

　　在各种ATP浓度下通过实时检测计算出PKA反应速度，并求取ATP的PKA（Km值）。

　　（PKa 0.02U，各浓度的ATP及Kemptide 100μg/mL）

　　根据实时检测进行酶的动力学分析。

　　（本方法得到的Km值与文献值**（3〜15μmol/L）几乎相同）

　　** Flockhart, D.A. and Corbin, J.D., CRC Crit. Rev. Biochem., 12, 133-86(1982).

相关资料

Fluorospark® Kinase　ADP Multi-Assay Kit.pdf

说明书.pdf

＜Fluorospark^® Kinase/ADP Multi-Assay Kit　参考资料＞
1)　Kumagai, K. et al.: Anal. Biochem., 447, 146-155 (2014).
2)　东京大学新药研究机构网址 http://www.ddi.u-tokyo.ac.jp/